轉染人骨形成蛋白2基因共培養(yǎng)條件下NIH3T3細胞生物學性狀觀察.pdf

1、本研究擬將人骨形成蛋白2真核表達載體pcDNA3.1-B2轉染入小鼠成纖維細胞系細胞(NIH3T3細胞)，建立能穩(wěn)定表達BMP2的細胞系，并利用細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)Transwell，觀察轉基因誘導表達的分泌型BMP2對NIH3T3細胞骨化分化的影響。以探討B(tài)MP2基因治療在牙周組織工程方面的意義。 實驗一pcDNA3.1-B2真核表達質粒的鑒定及穩(wěn)定表達BMP2細胞系的建立 目的:通過轉基因技術，建立穩(wěn)定表達BMP2的成纖維

2、細胞系。 材料和方法將:pcDNA3.1-B2用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后，經1﹪瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并檢測其攜帶目的基因的核酸序列。將經過鑒定的pcDNA3.1-B2真核表達質粒通過高效的陽離子聚合物轉染試劑轉染入NIH3T3細胞中，并用G418篩選獲得穩(wěn)定轉染細胞株。RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測hBMP2基因的轉錄和BMP2蛋白在胞外的表達。 結論:通過轉基因手段轉染入hBMP2基因的成纖維細胞

3、具有穩(wěn)定表達BMP2蛋白的作用，并能分泌BMP2蛋白于胞外。 實驗二轉染hBMP2基因誘導表達的分泌型BMP2對成纖維細胞超微結構的影響 目的:觀察轉基因誘導表達的分泌型BMP2對成纖維細胞超微結構的影響。 材料和方法:利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將NIH3T3細胞與轉染hBMP2基因細胞(B2-3T3細胞)共培養(yǎng)十天后，下層NIH3T3細胞經3﹪戊二醛固定后制備超薄切片，再經醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，利用

4、透射電鏡觀察其超微結構的變化。 結論:轉基因誘導表達的分泌型BMP2使成纖維細胞表現(xiàn)出骨細胞系細胞的超微結構特征，且細胞的分泌功能增強。 實驗三轉染hBMP2基因誘導表達的分泌型BMP2對成纖維細胞堿性磷酸酶活性的影響 目的:觀察轉基因誘導表達的分泌型BMP2對成纖維細胞堿性磷酸酶活性的影響。 材料和方法:利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將NIH3T3細胞與轉染hBMP2基因細胞(B2-3T3細胞)共培養(yǎng)

5、十天后，超聲破碎下層NIH3T3細胞，以對-硝基苯磷酸二鈉為底物，在405nm處測定其堿性磷酸酶活性，將測定的OD值進行單因素方差分析和PostHocTests檢驗。 結論:轉染hBMP2基因誘導表達的分泌型BMP2具有上調成纖維細胞堿性磷酸酶活性的作用。 實驗四轉染hBMP2基因誘導表達的分泌型BMP2對成纖維細胞骨化標志物骨鈣蛋白表達的影響 目的:觀察轉基因誘導表達的分泌型BMP2對成纖維細胞骨化標志物骨鈣蛋

6、白表達的影響。 材料和方法:利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將NIH3T3細胞與轉染hBMP2基因細胞(B2-3T3細胞)共培養(yǎng)十天后，下層NIH3T3細胞用丙酮固定后，經SABC法免疫組化染色后觀察其骨鈣蛋白(OCN)的表達情況。 結論:轉染hBMP2基因誘導表達的分泌型BMP2具有誘導成纖維細胞表達骨化標志物骨鈣蛋白的作用。 綜上所述，本研究采用陽離子聚合物轉染試劑可將外源性hBMP2基因穩(wěn)定轉染入NIH3T