羅格列酮增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞對糖尿病潰瘍治療效果的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　隨著人們生活狀況的改善和水平的提高，在腫瘤和心血管疾病之外，糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)作為人類健康的第三大威脅，被認(rèn)為是當(dāng)今社會(huì)一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。統(tǒng)計(jì)學(xué)研究表明患者一生之中有接近1/4的機(jī)率發(fā)生缺血性潰瘍以及下肢動(dòng)靜脈疾病引起的慢性難愈合創(chuàng)面。然而其具體的發(fā)病機(jī)制還不是十分的清楚，有研究認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是糖尿病潰瘍血管病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)，長期高糖環(huán)境下導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，是其傷口難以愈合的重

2、要原因。干細(xì)胞-生物材料治療被認(rèn)為是糖尿病潰瘍治療的發(fā)展趨勢，間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)由于其免疫豁免和多向分化的能力而被廣泛的應(yīng)用于糖尿病潰瘍的治療。然而潰瘍表面的高血糖的微環(huán)境卻嚴(yán)重?fù)p害了移植的干細(xì)胞的功能，最終引起移植效果不理想，因此控制潰瘍治療局部的血糖濃度對于糖尿病潰瘍的治療十分關(guān)鍵。羅格列酮是一種已經(jīng)應(yīng)用于臨床的降血糖藥物，具有控制血糖和改善胰島素抵抗的作用，此外還能作用于間質(zhì)干細(xì)胞，

3、促進(jìn)其進(jìn)一步的分化。這些結(jié)果均說明羅格列酮可能會(huì)通過影響間充質(zhì)干細(xì)胞的功能，進(jìn)一步促進(jìn)糖尿病潰瘍的愈合，而目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道羅格列酮在高糖環(huán)境下對間充質(zhì)干細(xì)胞的影響?；谶@個(gè)理論，我們在課題組前期研究的可降解的和高生物相容性的生物材料的基礎(chǔ)上，將羅格列酮處理的間質(zhì)干細(xì)胞種植于生物材料上，探討其對促進(jìn)小鼠糖尿病足潰瘍愈合的效果，為臨床上進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組
　?、賹φ战M:配置好的α

4、-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％胎牛血清和5.6mM葡萄糖;②高糖組:配置好的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％胎牛血清和25mM葡萄糖;③羅格列酮組:配置好的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％胎牛血清、25mM葡萄糖和10uM羅格列酮;④AKT抑制組:配置好的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10％胎牛血清、25mM葡萄糖、10uM羅格列酮和5uM triciribine。
　　2.間充質(zhì)干細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)因子刺

5、激后，利用MTT法，將間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，使用計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度后加至96孔板中，按分組給予藥物或稀釋培養(yǎng)基刺激作用24小時(shí)后依次加入MTT孵育4小時(shí)，去掉培養(yǎng)基加入DMSO并檢測吸光值，觀察間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況。
　　3.內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
　　將生長至對數(shù)期的內(nèi)皮細(xì)胞種植于6孔板中，待其單層鋪滿6孔板孔底，將0.1％FBS的正常培養(yǎng)基作用于對照組，其他3組都使用0.1％FBS高糖培養(yǎng)基，37℃，

6、5％C02孵育24小時(shí)。然后以無菌P1000槍頭垂直進(jìn)行細(xì)胞劃痕，洗去劃下的細(xì)胞。按照已分的四組分別給予藥物或1∶5稀釋的條件培養(yǎng)基刺激，常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)。0.01MPBS晃洗后，4％多聚甲醛固定20min，0.5％結(jié)晶紫染色。鏡下拍攝圖片，使用IPP軟件(Media Cybernetics)測量內(nèi)皮細(xì)胞創(chuàng)痕面積。
　　4.細(xì)胞Transwell小室實(shí)驗(yàn)
　　使用生長至對數(shù)期的MSC或HUVEC制成細(xì)胞懸液，取1×104細(xì)胞

7、個(gè)數(shù)種于25mm8.0μm的Transwe4l細(xì)胞小室上室內(nèi)，下室按分組給予藥物或條件培養(yǎng)基，常規(guī)孵育6小時(shí)，將小室從培養(yǎng)箱中取出，使用棉簽將小室內(nèi)底面間充質(zhì)干細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞擦去。4％多聚甲醛固定20min，0.5％結(jié)晶紫染色，計(jì)算遷移至小室濾膜下方MSC或HUVEC的陽性細(xì)胞數(shù)量。
　　5.ELISA試劑盒對條件培養(yǎng)基按說明書進(jìn)行相應(yīng)檢測，觀察其細(xì)胞因子的含量變化。
　　6.將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于制備好的生物材料上，進(jìn)行常規(guī)

8、培養(yǎng)，觀察其生長情況。
　　7.建立模型以及創(chuàng)面處理
　　采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔連續(xù)5天注射，空腹血糖＞16.7mmol/1為糖尿病小鼠。結(jié)扎股動(dòng)脈近端，使下肢缺血，在大腿背側(cè)皮膚造成直徑5mm全層創(chuàng)面，以此建立糖尿病足潰瘍模型。按照分組情況用含2×104個(gè)數(shù)的間充質(zhì)干細(xì)胞或藥物刺激后的MSC生物組織材料覆蓋于傷口區(qū)，統(tǒng)計(jì)創(chuàng)面愈合的大小。
　　8.組織切片免疫熒光和蘇木精-伊紅染色
　　將切片于37℃過夜烤

9、干，取出后山羊血清封閉30min，加入一抗CD31孵育1小時(shí)，PBS洗3次后加入二抗羅丹明標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育1小時(shí)，洗片后使用抗熒光淬滅封片劑封片，顯微鏡下觀察。
　　組織冰凍切片37℃烤干，酒精下行濃度依次脫水2min/次，蒸餾水中晃洗后，蘇木精染色2min，藍(lán)化后，鹽酸酒精分色10s，伊紅染液染色1min，酒精上行濃度依次脫水，二甲苯透明，使用中性樹脂封片，鏡下觀察細(xì)胞融合和血管新生情況。
　　結(jié)果：
　　1.

10、經(jīng)羅格列酮藥物處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力明顯的高于高糖組(P＜0.05)。且條件培養(yǎng)基中VEGF和SDF-1的含量相較于高糖組有顯著地升高(P＜0.05)。AKT阻斷劑可以阻斷羅格列酮對間充質(zhì)干細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和分泌功能的促進(jìn)作用。
　　2.間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在生物材料上正常生長、增殖。羅格列酮組的細(xì)胞數(shù)量相較于對照組和AKT抑制組明顯增加(P＜0.05)，動(dòng)物手術(shù)后按規(guī)定天數(shù)測量傷口面積大小，RSG-M

11、SC治療組相較于MSC對照組，創(chuàng)面愈合速度明顯增快，治療效果具有顯著差異(P＜0.01)，組織形態(tài)學(xué)觀察RSG-MSC組血管密度與MSC組比較之下明顯增高，MSC(GFP轉(zhuǎn)染，自發(fā)綠色熒光)與羅丹明標(biāo)記發(fā)紅色熒光CD31因子的血管內(nèi)皮細(xì)胞相互融合的情況明顯多于MSC對照組。
　　結(jié)論：
　　羅格列酮對高糖環(huán)境下的間質(zhì)干細(xì)胞以及MSC條件培養(yǎng)基對內(nèi)皮細(xì)胞，能夠顯著促進(jìn)其增殖、遷移和分泌功能，在這個(gè)過程中AKT信號通路發(fā)揮著重要