體外誘導(dǎo)替加環(huán)素耐藥糞腸球菌全基因測(cè)序及突變位點(diǎn)分析.pdf

1、[目的]
　　1.通過替加環(huán)素(Tigecycline TIG)體外誘導(dǎo)糞腸球菌耐藥，篩選耐藥菌株并進(jìn)行藥敏鑒定，獲得不同耐藥梯度的菌株群。對(duì)部分誘導(dǎo)株進(jìn)行16SrRNA基因PCR擴(kuò)增鑒定菌株及序列分析，初步獲得變異位點(diǎn)。
　　2.獲得體外誘導(dǎo)糞腸球菌TIG耐藥株全基因序列并上傳至數(shù)據(jù)庫，獲得Genbank編號(hào)，為后續(xù)研究TIG耐藥糞腸球菌基因組進(jìn)化特點(diǎn)進(jìn)行序列參考。
　　3.采用SNP calling比較TIG誘導(dǎo)株

2、與敏感原始株全基因序列，獲得SNP數(shù)據(jù)集，初步篩選體外誘導(dǎo)耐藥過程中突變位點(diǎn)并進(jìn)行基因功能注釋。
　　[方法]
　　1.耐藥菌株的誘導(dǎo)和鑒定:以課題組保存糞腸球菌（編號(hào)為DengNZ_CP004081）為原始株， ATCC29212(編號(hào)為F4)為質(zhì)控糞腸球菌。將原始株作為母株進(jìn)行體外誘導(dǎo)，依次接種在TIG濃度成倍增加的腦心浸出液中，挑選和鑒定陽性克隆。采用PhoenixTM100自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定和普通藥

3、敏試驗(yàn)，根據(jù)EUCAST標(biāo)準(zhǔn)，采用Etest方法測(cè)定誘導(dǎo)菌株TIG的MIC值。
　　2.體外誘導(dǎo)菌株16 SrRNAPCR擴(kuò)增及序列分析:提取部分糞腸球菌誘導(dǎo)耐藥菌株DNA，常規(guī)PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因并進(jìn)行測(cè)序，與原始株序列比對(duì)，鑒定菌株并初步獲得變異位點(diǎn)。
　　3.體外誘導(dǎo)株全基因組重測(cè)序:以原始株Deng完成圖為參考序列，采用Illumina Hiseq2000對(duì)誘導(dǎo)株重測(cè)序，拼接全基因序列draft map上

4、傳至Genbank并獲得編號(hào)。
　　4.TIG誘導(dǎo)株基因變異位點(diǎn)分析:以原始株Deng參考序列與誘導(dǎo)株序列進(jìn)行比對(duì)，采用Illumina Hiseq2000進(jìn)行SNP Calling，獲得單核苷酸多態(tài)性(Singlemucleotide polymorphism SNP)，發(fā)現(xiàn)與藥物誘導(dǎo)相關(guān)的突變位點(diǎn)及基因，初步分析突變基因功能。
　　[結(jié)果]
　　1.對(duì)原始株Deng及質(zhì)控菌株F4進(jìn)行TIG體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，母株均為敏感

5、株，獲得不同MIC值梯度的菌株群，其中Deng誘導(dǎo)獲得耐藥菌株12株;F4獲得10株。誘導(dǎo)株TIG的MIC值波動(dòng)在2ug/ml及64ug/ml之間。對(duì)Deng-T4-3、Deng-T10-3和Deng-T60-1進(jìn)行藥敏測(cè)試提示，Deng-T10-3和Deng-T60-1對(duì)紅霉素由中介變?yōu)槊舾校瑢?duì)萬古霉素的MIC下降至1ug/ml。
　　2.Deng-T10-3、Deng-T60-1進(jìn)行16SrRNA基因鑒定與原始株同源性99.9

6、％。分析證實(shí)為糞腸球菌，兩誘導(dǎo)株與原始株Deng比較發(fā)現(xiàn)在16SrRNA C469T發(fā)生位點(diǎn)變異。
　　3.對(duì)Deng-T10-3、Deng-T60-1進(jìn)行全基因重測(cè)序，上述菌株各產(chǎn)生438×和545×覆蓋度的基因組序列，分別包含1586407135及1279032609堿基數(shù)，GC含量二者相似，均為37.43％、37.42％。兩菌株基因組總大小分別為2920382 bp、2920382 bp。二者經(jīng)基因預(yù)測(cè)分別包含了2761及2

7、746個(gè)基因，GC含量占基因組百分比均為38.1％。將序列上傳至Genbank數(shù)據(jù)庫獲得Genbank編號(hào)，分別為JXMK00000000、JXML00000000。
　　4.Deng-T10-3和Deng-T60-1菌株進(jìn)行SNP calling，Deng-T10-3在外顯子中獲得20個(gè)SNP及1個(gè)Small indel，其中非同義突變5個(gè);Deng-T60-1獲得21個(gè)SNP及1個(gè)Small indel，其中非同義突變?yōu)?個(gè)。

8、隨著TIG的MIC值增加，Deng-T60-1比Deng-T10-3新增1個(gè)突變基因Deng_2227，該基因主要編碼為糖基轉(zhuǎn)移酶。
　　[結(jié)論]
　　1.TIG在體外可成功誘導(dǎo)不同耐藥水平的糞腸球菌菌株。
　　2.在TIG體外誘導(dǎo)糞腸球菌耐藥株中發(fā)生16SrRNA C469T位點(diǎn)突變，可能與TIG誘導(dǎo)耐藥有關(guān)。
　　3.對(duì)體外誘導(dǎo)株采用高通量測(cè)序方法成功獲得TIG耐藥菌draft map。
　　4.經(jīng)SN