霍亂弧菌群體感應調控因子VqmA活性相關基因的篩選及LysR和MFS蛋白功能的研究.pdf

1、霍亂弧菌（V.cholerae）是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧小桿菌，是引起人類腹瀉疾病霍亂的病原體。大量研究證明，霍亂弧菌的致病能力主要是由霍亂毒素（choleraetoxin，CT）和毒素共調節(jié)菌毛（toxin-coregulated pilus，TCP）引起的。霍亂弧菌毒力基因的表達受到各種環(huán)境條件的影響，如營養(yǎng)物濃度和種類、溫度、pH、膽汁鹽和群體感應信號分子。
　　 HapR是霍亂弧菌群體感應調控系統的關鍵調控因子，可以抑

2、制霍亂弧菌CT和TCP表達。LuxR家族蛋白VqmA可以在低細胞濃度時誘導HapR的表達從而降低細菌的致病性。本文通過構建轉座子隨機突變文庫的方法篩選影響VqmA活性的基因，獲得七株候選的突變株，并且對突變株M1（△VC0073，SAM-依賴的甲基轉移酶）做了深入的研究。研究發(fā)現該基因缺失后，VqmA無法激活報告基因的表達，并且VqmA的轉錄調控活性隨著該基因的回復表達而恢復，VC0073是VqmA發(fā)揮活性的必須基因。VC0073編碼合

3、成的蛋白與SAM-依賴的甲基轉移酶的同源性最高，在很多細菌中該酶參與一些小分子化合物的合成，VqmA激活目的基因的過程可能需要該酶合成的某類化合物的協助，但是研究發(fā)現該化合物并不存在于細菌上清液中。
　　 LysR類蛋白是一種全局性的轉錄調控因子，霍亂弧菌中約有40個LysR類型的蛋白。借助生物信息學工具，在霍亂弧菌中發(fā)現了五類比較特殊的LysR蛋白，這些蛋白的下游都為MFS家族蛋白。MFS家族蛋白屬于多重藥物轉運蛋白。我們選取

4、其中一組基因VC1617（Encoding LysR Protein）和VC1618（Encoding Multidrug Resistanceprotein）作為研究對象，研究發(fā)現VC1617缺失和過表達后霍亂弧菌可以在LB和M9培養(yǎng)基正常生長，VC1617并不是細菌在這兩中培養(yǎng)基生長的必需基因，這在一定程度上也反映出了LysR蛋白生理功能的多樣性。通過構建Luminescence檢測質粒發(fā)現LysR不但可以抑制自身的表達而且還可以激