TGF-βR-Ⅱ異構(gòu)體在白血病細(xì)胞的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、白血病的發(fā)生和發(fā)展是一種多基因參與，多因素影響的多步驟復(fù)雜過程。主要表現(xiàn)為白血病細(xì)胞增殖失控，分化障礙及其凋亡受阻。生理情況下，細(xì)胞的增殖、分化、成熟及凋亡受到多種正負(fù)調(diào)控因子的嚴(yán)格的調(diào)控，正、負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)處于動(dòng)態(tài)平衡中，維持著造血的穩(wěn)定。負(fù)調(diào)控因子作用的減弱可能導(dǎo)致白血病的發(fā)生。TGF-β1是最主要的負(fù)調(diào)控因子之一，TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡等方面具有重要的作用。
　　 TGF-β受體有3種亞

2、型即TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ，其中TGF-βRⅡ和TGF-β具有較高的親和力，在TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用。研究表明一些腫瘤中發(fā)現(xiàn)有TGF-βRⅡ表達(dá)異常，如在胰腺癌、膽囊癌中存在TGF-βRⅡ水平下調(diào)，在結(jié)腸癌中TGF-βRⅡ發(fā)生突變，導(dǎo)致功能失活，腫瘤細(xì)胞因此失去對(duì)TGF-β的敏感性。為了解急慢性白血病患者TGF-βRⅡ基因是否存在異常，本課題組前期通過PCR方法擴(kuò)增急性白血病原代細(xì)胞TGF-βR

3、Ⅱ的編碼區(qū)序列，并將TGF-βRⅡ的編碼區(qū)序列連接到T載體上，再將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，PCR鑒定陽性菌落，挑取單個(gè)菌落，送公司測(cè)序，在國際上首次發(fā)現(xiàn)白血病病人存在兩種TGF-βRⅡ的異構(gòu)體，即TGF-βRⅡA和TGF-βRⅡB(2號(hào)外顯子75bβ缺失)。由于前期研究僅挑取單個(gè)菌落測(cè)序，具有一定的局限性，并不能反映這兩種異構(gòu)體在白血病細(xì)胞的表達(dá)量的差別。TGF-βRⅡA和TGF-βRⅡB這兩種異構(gòu)體差別在2號(hào)外顯子的缺失，因此本研究在1號(hào)外

4、顯子和3號(hào)外顯子設(shè)計(jì)了上下游引物，通過RT-PCR的方法，檢測(cè)這兩種異構(gòu)體在白血病細(xì)胞的表達(dá)情況。避免了前期研究的局限性及測(cè)序的繁瑣性。同時(shí)也對(duì)這兩種異構(gòu)體的功能進(jìn)行了研究。
　　 本研究內(nèi)容包括以下3個(gè)方面：
　　 ⑴RT-PCR方法檢測(cè)TGF-βRⅡ兩種異構(gòu)體在正常人外周血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞、急慢性白血病初治患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞及不同的白血病細(xì)胞系中的表達(dá)情況。
　　 ⑵構(gòu)建含人TGF-βRⅡ兩種異構(gòu)體基因的

5、真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染TGF-βRⅡA和TGF-βRⅡB均低表達(dá)的K562細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)TGF-βRⅡA或TGF-βRⅡB基因的K562細(xì)胞。
　　 ⑶研究TGF-β1對(duì)穩(wěn)定表達(dá)TGF-βRⅡA或TGF-βRⅡB基因的K562細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響，以及對(duì)TGF-β信號(hào)通路下游基因與蛋白表達(dá)的影響。
　　 本研究取得了以下主要結(jié)果：
　　 ①在正常人外周血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞中以TGF-βRⅡA表達(dá)

6、為主。在急慢性白血病細(xì)胞中以TGF-βRⅡB表達(dá)為主，在白血病細(xì)胞系中，K562細(xì)胞株、KAR細(xì)胞株TGF-βRⅡ A及TGF-βRⅡ B基因均低表達(dá)。U266、U937、Raji、HL-60、Jurkat、CEM、NB4、CA46等細(xì)胞株均有表達(dá)TGF-βRⅡA及TGF-βRⅡ B基因。
　　 ②成功地構(gòu)建含人TGF-βRⅡ兩種異構(gòu)體基因的真核表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，命名為βEFIRES-N-TGF-βRⅡ A和βEFIRES-

7、P-TGF-βRⅡ B，分別轉(zhuǎn)染TGF-βRⅡ A和TGF-βRⅡ B均低表達(dá)的K562細(xì)胞，經(jīng)抗性篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，分別命名為TGF-βRⅡ A-K562細(xì)胞及TGF-βRⅡ B-K562細(xì)胞
　　 ③通過不同劑量TGF-β1作用下，證實(shí)了低劑量TGFβ1(1ng/ml)即能抑制TGF-βRⅡ A-K562細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡。但此劑量TGFβ1不能抑制TGF-βRⅡ B-K562細(xì)胞增殖，也不能誘導(dǎo)細(xì)胞分化

8、、凋亡。隨著TGFβ1劑量的增加，TGF-βRⅡB-K562細(xì)胞增殖也能受到抑制，并呈量效關(guān)系，但抑制率不如TGF-βRⅡA-K562細(xì)胞。
　　 ④RT-PCR，Western-Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低劑量TGFβ1(1ng/ml)能上調(diào)TGF-βRⅡ A-K562細(xì)胞Smad2/3基因表達(dá)，下調(diào)TGF-βRⅡA-K562細(xì)胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表達(dá)，這可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。此劑量的TGFβ1不影響TGF-βR

9、Ⅱ-B細(xì)胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴在正常人外周血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞中以TGF-βRⅡA表達(dá)為主。在急慢性白血病細(xì)胞中以TGF-βRⅡ B表達(dá)為主，在白血病細(xì)胞系中，K562細(xì)胞株、KAR細(xì)胞株TGF-βRⅡ A及TGF-βRⅡ B基因均低表達(dá)。
　　 ⑵低劑量TGFβ1(1ng/ml)即能抑制TGF-βRⅡA-K562細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡。但此劑量TGFβ1不能抑制T

10、GF-βRⅡ B-K562細(xì)胞增殖，也不能誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡。隨著TGFβ1劑量的增加，TGF-βRⅡB-K562細(xì)胞增殖也能受到抑制，并呈量效關(guān)系，但抑制率不如TGF-βRⅡ A-K562細(xì)胞。
　　 ⑶低劑量TGFβ1(1ng/ml)能上調(diào)TGF-βRⅡ A-K562細(xì)胞Smad2/3基因表達(dá)，下調(diào)TGF-βRⅡA-K562細(xì)胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表達(dá)，這可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。此劑量的TGFβ1不影響TG