TGF-βR-Ⅱ異構(gòu)體在白血病細胞的表達及其功能研究.pdf

1、白血病的發(fā)生和發(fā)展是一種多基因參與，多因素影響的多步驟復(fù)雜過程。主要表現(xiàn)為白血病細胞增殖失控，分化障礙及其凋亡受阻。生理情況下，細胞的增殖、分化、成熟及凋亡受到多種正負調(diào)控因子的嚴格的調(diào)控，正、負調(diào)節(jié)信號處于動態(tài)平衡中，維持著造血的穩(wěn)定。負調(diào)控因子作用的減弱可能導致白血病的發(fā)生。TGF-β1是最主要的負調(diào)控因子之一，TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路在調(diào)節(jié)造血細胞的增殖，誘導細胞分化、凋亡等方面具有重要的作用。
　　 TGF-β受體有3種亞

2、型即TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ，其中TGF-βRⅡ和TGF-β具有較高的親和力，在TGF-β介導的信號轉(zhuǎn)導中起著重要的作用。研究表明一些腫瘤中發(fā)現(xiàn)有TGF-βRⅡ表達異常，如在胰腺癌、膽囊癌中存在TGF-βRⅡ水平下調(diào)，在結(jié)腸癌中TGF-βRⅡ發(fā)生突變，導致功能失活，腫瘤細胞因此失去對TGF-β的敏感性。為了解急慢性白血病患者TGF-βRⅡ基因是否存在異常，本課題組前期通過PCR方法擴增急性白血病原代細胞TGF-βR

3、Ⅱ的編碼區(qū)序列，并將TGF-βRⅡ的編碼區(qū)序列連接到T載體上，再將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，PCR鑒定陽性菌落，挑取單個菌落，送公司測序，在國際上首次發(fā)現(xiàn)白血病病人存在兩種TGF-βRⅡ的異構(gòu)體，即TGF-βRⅡA和TGF-βRⅡB(2號外顯子75bβ缺失)。由于前期研究僅挑取單個菌落測序，具有一定的局限性，并不能反映這兩種異構(gòu)體在白血病細胞的表達量的差別。TGF-βRⅡA和TGF-βRⅡB這兩種異構(gòu)體差別在2號外顯子的缺失，因此本研究在1號外

4、顯子和3號外顯子設(shè)計了上下游引物，通過RT-PCR的方法，檢測這兩種異構(gòu)體在白血病細胞的表達情況。避免了前期研究的局限性及測序的繁瑣性。同時也對這兩種異構(gòu)體的功能進行了研究。
　　 本研究內(nèi)容包括以下3個方面：
　　 ⑴RT-PCR方法檢測TGF-βRⅡ兩種異構(gòu)體在正常人外周血或骨髓單個核細胞細胞、急慢性白血病初治患者骨髓單個核細胞及不同的白血病細胞系中的表達情況。
　　 ⑵構(gòu)建含人TGF-βRⅡ兩種異構(gòu)體基因的

5、真核表達載體，用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染TGF-βRⅡA和TGF-βRⅡB均低表達的K562細胞，篩選出穩(wěn)定表達TGF-βRⅡA或TGF-βRⅡB基因的K562細胞。
　　 ⑶研究TGF-β1對穩(wěn)定表達TGF-βRⅡA或TGF-βRⅡB基因的K562細胞增殖、分化、凋亡的影響，以及對TGF-β信號通路下游基因與蛋白表達的影響。
　　 本研究取得了以下主要結(jié)果：
　　 ①在正常人外周血或骨髓單個核細胞中以TGF-βRⅡA表達

6、為主。在急慢性白血病細胞中以TGF-βRⅡB表達為主，在白血病細胞系中，K562細胞株、KAR細胞株TGF-βRⅡ A及TGF-βRⅡ B基因均低表達。U266、U937、Raji、HL-60、Jurkat、CEM、NB4、CA46等細胞株均有表達TGF-βRⅡA及TGF-βRⅡ B基因。
　　 ②成功地構(gòu)建含人TGF-βRⅡ兩種異構(gòu)體基因的真核表達載體，經(jīng)測序確認，命名為βEFIRES-N-TGF-βRⅡ A和βEFIRES-

7、P-TGF-βRⅡ B，分別轉(zhuǎn)染TGF-βRⅡ A和TGF-βRⅡ B均低表達的K562細胞，經(jīng)抗性篩選，得到穩(wěn)定表達細胞株，分別命名為TGF-βRⅡ A-K562細胞及TGF-βRⅡ B-K562細胞
　　 ③通過不同劑量TGF-β1作用下，證實了低劑量TGFβ1(1ng/ml)即能抑制TGF-βRⅡ A-K562細胞增殖，并誘導細胞分化、凋亡。但此劑量TGFβ1不能抑制TGF-βRⅡ B-K562細胞增殖，也不能誘導細胞分化

8、、凋亡。隨著TGFβ1劑量的增加，TGF-βRⅡB-K562細胞增殖也能受到抑制，并呈量效關(guān)系，但抑制率不如TGF-βRⅡA-K562細胞。
　　 ④RT-PCR，Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn)，低劑量TGFβ1(1ng/ml)能上調(diào)TGF-βRⅡ A-K562細胞Smad2/3基因表達，下調(diào)TGF-βRⅡA-K562細胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表達，這可能是誘導細胞凋亡的作用機制。此劑量的TGFβ1不影響TGF-βR

9、Ⅱ-B細胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表達。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴在正常人外周血或骨髓單個核細胞中以TGF-βRⅡA表達為主。在急慢性白血病細胞中以TGF-βRⅡ B表達為主，在白血病細胞系中，K562細胞株、KAR細胞株TGF-βRⅡ A及TGF-βRⅡ B基因均低表達。
　　 ⑵低劑量TGFβ1(1ng/ml)即能抑制TGF-βRⅡA-K562細胞增殖，并誘導細胞分化、凋亡。但此劑量TGFβ1不能抑制T

10、GF-βRⅡ B-K562細胞增殖，也不能誘導細胞分化、凋亡。隨著TGFβ1劑量的增加，TGF-βRⅡB-K562細胞增殖也能受到抑制，并呈量效關(guān)系，但抑制率不如TGF-βRⅡ A-K562細胞。
　　 ⑶低劑量TGFβ1(1ng/ml)能上調(diào)TGF-βRⅡ A-K562細胞Smad2/3基因表達，下調(diào)TGF-βRⅡA-K562細胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表達，這可能是誘導細胞凋亡的作用機制。此劑量的TGFβ1不影響TG