膽鹽脂質體促進胰島素口服吸收的研究.pdf

1、脂質體口服給藥具有一定的促進蛋白多肽藥物吸收的作用，但普通脂質體在體內容易受到膽鹽的破壞，并且難以穿透生物膜，限制了其在口服給藥方面的應用。含有膽鹽的脂質體，由于膽鹽的作用，使脂質體胃腸道的穩(wěn)定性得以改善，在口服粘膜免疫方面得到很好的應用。本文擬以胰島素為模型藥物，利用膽鹽脂質體的促進吸收作用來提高蛋白多肽類藥物的口服生物利用度，并對其作用機制進行研究。
　　針對胰島素在脂質體中包封率低的特點，本文采用逆向蒸發(fā)/高壓均質法制備胰島

2、素脂質體，首先以包封率和粒徑為指標，對制備方法進行了優(yōu)化，分別考察了均質壓力、均質次數、磷脂/膽鹽比、藥/脂比、內水相pH、外水相離子強度、初乳相體積比以及水化時間等影響因素。最優(yōu)處方的胰島素包封率為30±2％，脂質體粒徑為154±18nm。圓二色譜檢測結果表明在各種極端制備條件下制備的脂質體，胰島素的二級構象保持完好，α螺旋含量和θ208/θ223值均與胰島素溶液十分接近;小鼠皮下降糖實驗表明，制劑中胰島素的降糖作用與胰島素溶液無顯著

3、性差異。本文的制備條件對胰島素的二級構象和生物活性無影響，。
　　在制備工藝優(yōu)化的基礎上，本文分別制備了胰島素的甘氨膽酸鹽脂質體(SGC-liposomes)、牛磺膽酸鹽脂質體(STC-liposomes)、脫氧膽酸鹽脂質體(SDC-liposomes)和普通脂質體，在體外對其性質進行了表征，正常大鼠和糖尿病大鼠模型上對膽鹽脂質體的降糖作用及生物利用度進行了研究。為了逐步揭示膽鹽脂質體促進胰島素口服吸收的機制，本文中首先比較了不含

4、不同膽鹽的脂質體、不同粒徑大小的脂質體和不同的給藥劑量對胰島素口服吸收的影響。透射電鏡觀察表明膽鹽脂質體的外觀為類球形，而普通脂質體則較為圓整，這可能與膽鹽脂質體膜柔性大有關。體外6個小時的泄漏實驗表明，膽鹽脂質體在pH2，5.6和6.8的環(huán)境里比較穩(wěn)定，泄漏較緩慢，包封率基本不變。圓二色譜檢測及小鼠皮下降糖實驗表明，包載在三種膽鹽脂質體中的胰島素活性保持完好。大鼠口服三種膽鹽脂質體后，都有一定程度的降糖作用，而口服胰島素溶液、胰島素與

5、甘膽酸鹽的混合液、空白膽酸鹽脂質體制劑和胰島素與空白膽酸鹽脂質體制劑則沒有降糖作用。比較不同膽鹽脂質體的降糖水平發(fā)現，以甘膽酸鹽脂質體的效果最佳，最大降糖百分數63％，持續(xù)降糖20個小時左右。不同粒徑的膽鹽脂質體達峰時間和藥效持續(xù)時間不同，小粒子的達峰時間快，但藥效持續(xù)時間短，大粒子則恰好相反;粒子太大，如2000nm則無降血糖作用?？疾觳煌瑵舛葘堤切Ч挠绊懓l(fā)現，在2～20 IU/Kg的給藥劑量內，降糖效果和血藥濃度呈現劑量依賴關系

6、，血糖曲線上面積AAC和藥時曲線下面積AUC均與濃度呈正相關，相關系數r≈0.9.糖尿病大鼠口服各個制劑和對照制劑后，降糖作用明顯，趨勢與正常大鼠相似，其中以甘膽酸鹽脂質體的降糖作用最強，最大降糖百分數達55％，持續(xù)降糖24個小時左右，PA和F分別為10.2％和9.9％。
　　體外抗酶降解的實驗說明，在4小時內，膽鹽脂質體能有效保護胰島素減少胃蛋白酶、胰蛋白酶和α糜蛋白酶對它的降解，效果明顯好于普通脂質體。其中以甘膽酸鹽脂質體的保

7、護作用最佳，三種酶中4個小時胰島素存留百分含量分別為最初的48％、67％和81％;隨著膽鹽在脂質體總脂質中比例的增加，保護作用減弱，這可能與膽鹽增加了藥物的泄漏有關。
　　大鼠口服近紅外探針I(yè)R783標記的胰島素脂質體，在胃腸道存在的時間與抗酶降解能力有關，抗酶降解能力強的，胃腸道存在時間久，入血胰島素濃度大。甘膽酸鹽脂質體在胃腸道內保留時間最久，血藥濃度最大，普通脂質體15分鐘后即有大量胰島素被降解。
　　Caco-2細胞

8、對脂質體的攝取可被膽鹽大大促進，并且胰島素有可能是以載藥脂質體整體被攝取，空白脂質體和甘膽酸鹽本身不能促進細胞對胰島素的攝取。細胞對膽鹽脂質體的攝取與粒徑相關，400 nm以下的小粒子細胞攝取量較多，2000 nm的大粒子幾乎不被細胞攝取。細胞攝取量還與濃度呈正相關，制劑濃度越高，細胞攝取量越大。
　　膽鹽脂質體與Caco-2細胞作用后能迅速打開細胞的緊密連接，并促進胰島素跨細胞單層轉運，顯著優(yōu)于普通脂質體。甘膽酸鹽脂質體的滲透系

9、數Papp4.79±0.55×10-6，是普通脂質體的近3倍。粒徑大小對轉運有影響，隨著粒徑的減小，跨膜電阻值下降更多，藥物累積透過量更大，2000nm的粒子基本無轉運;制劑濃度對細胞的跨膜電阻和Papp影響較小，隨著濃度增大，藥物累計透過量增加。激光共聚焦顯微鏡觀察膽鹽脂質體孵育2h后的細胞，發(fā)現肌動蛋白縮短，ZO-1蛋白斷裂，而普通脂質體和胰島素溶液作用后的細胞與正常細胞無明顯差別。
　　比較不同膽鹽類型和不同濃度的制劑對細胞

10、存活率和凋亡的影響，發(fā)現在1～25 mM濃度范圍內的三種膽鹽脂質體，對細胞存活率基本無影響，4個小時MTT實驗表明細胞存活率下降很小;Annexin V FITC/PI法檢測，制劑對細胞24小時的凋亡誘導率基本為0.初步安全性實驗表明，膽鹽脂質體對細胞的毒性比較小。
　　綜上所述，膽鹽脂質體作為胰島素口服遞送的載體，能夠有效地促進胰島素的口服吸收，糖尿病大鼠口服生物利用度PA和F分別達到10.2％和9.9％;膽鹽脂質體口服后能有效