BDNF對(duì)鼠視網(wǎng)膜Miiller細(xì)胞GLAST和GS調(diào)控作用的研究.pdf

1、第一章 BDNF對(duì)正常氧狀態(tài)下鼠視網(wǎng)膜Mǖller細(xì)胞GLAST和GS表達(dá)及功能的調(diào)控
　　目的：研究BDNF對(duì)正常氧狀態(tài)下的鼠視網(wǎng)膜Mǖller細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST和谷氨酰胺合成酶GS表達(dá)及功能的調(diào)控作用。
　　方法：取出生3-7天的新生昆明小鼠視網(wǎng)膜組織進(jìn)行正常氧狀態(tài)下Mǖller細(xì)胞培養(yǎng),取傳代后第三代Mǖller細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為BDNF干預(yù)組:鼠視網(wǎng)膜Mǖller細(xì)胞分別加入50、75、100、125

2、和150 ng/ml的BDNF培養(yǎng)24 h;正常對(duì)照組:培養(yǎng)的Mǖller細(xì)胞中不加BDNF。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)Mǖller細(xì)胞GLAST及GS mRNA的表達(dá);采用Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)Mǖller細(xì)胞GLAST及GS蛋白質(zhì)的表達(dá);采用L-[3,4-H3]-谷氨酸檢測(cè)100ng/ml的BDNF干預(yù)組與正常對(duì)照組Mǖller細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取功能的差異。
　　結(jié)果：不同濃度的

3、BDNF均能上調(diào)GLAST及GS的表達(dá)(P＜0.05),并且隨著B(niǎo)DNF濃度的增大,GLAST及GS的表達(dá)量增加,當(dāng)BDNF濃度為100ng/ml時(shí),GLAST及GS表達(dá)最強(qiáng)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示GLAST蛋白主要定位于Mǖller細(xì)胞胞漿及胞膜上,GS蛋白主要定位于Mǖller細(xì)胞胞漿中。不同濃度的BDNF作用于Mǖller細(xì)胞后,GLAST及GS蛋白表達(dá)增強(qiáng)。100ng/ml的BDNF能夠明顯增加Mǖller細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取(P＜

4、0.05)。
　　結(jié)論：在正常氧狀態(tài)下,BDNF能夠上調(diào)Mǖller細(xì)胞中GLAST和GS的表達(dá),并且增加Mǖller細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外谷氨酸的攝取。
　　第二章缺氧對(duì)鼠視網(wǎng)膜Mǖller細(xì)胞GLAST和GS表達(dá)及功能的影響
　　目的：研究缺氧對(duì)鼠視網(wǎng)膜Mǖller細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST和谷氨酰胺合成酶GS表達(dá)及功能的影響。
　　方法：采用出生3-7天的小鼠視網(wǎng)膜組織進(jìn)行Mǖller細(xì)胞培養(yǎng),采用125μmol/L

5、的氯化鈷(CoCl2)溶液分別進(jìn)行缺氧干預(yù)6h、12h、24h、48h和72h;不加CoCl2溶液培養(yǎng)的Mǖller細(xì)胞為正常對(duì)照組。采用RT-PCR方法檢測(cè)Mǖller細(xì)胞GLAST及GS mRNA的表達(dá);采用Westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)Mǖller細(xì)胞GLAST及GS蛋白質(zhì)的表達(dá);采用L-[3,4-H3]-谷氨酸檢測(cè)CoCl2溶液缺氧干預(yù)組與正常對(duì)照組Mǖller細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取功能的差異;采用Annexin

6、V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：缺氧早期GLAST表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.001),COCl2溶液干預(yù)12h后達(dá)到最強(qiáng)(P＜0.05),之后逐漸降低,CoCl2溶液干預(yù)72h后GLAST表達(dá)與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。缺氧也使GS的表達(dá)較正常對(duì)照組增加(P＜0.001),COCl2溶液干預(yù)48h后GS表達(dá)最強(qiáng)(P＜0.001),之后開(kāi)始下降。缺氧促進(jìn)Mǖller細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝

7、取,CoCl2溶液干預(yù)48h后L-[3,4.H3]-谷氨酸的攝取量最大(P＜0.005),之后開(kāi)始下降。而COCl2溶液干預(yù)后,Mǖller細(xì)胞死亡數(shù)較正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：在一定時(shí)間范圍內(nèi)缺氧能夠上調(diào)Mǖller細(xì)胞GLAST及GS的表達(dá),增加谷氨酸的攝取。但持續(xù)缺氧最終會(huì)引起Mǖller細(xì)胞功能失代償,從而導(dǎo)致谷氨酸的代謝能力降低。
　　第三章 BDNF對(duì)缺氧狀態(tài)下鼠視網(wǎng)膜Mǖller細(xì)胞GL

8、AST和GS表達(dá)及功能的調(diào)控
　　目的：研究BDNF對(duì)缺氧狀態(tài)下鼠視網(wǎng)膜Mǖller細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST和谷氨酰胺合成酶GS表達(dá)及功能的調(diào)控作用。
　　方法：采用出生3-7天的小鼠視網(wǎng)膜組織進(jìn)行Mǖller細(xì)胞培養(yǎng),采用125μmol/L的CoCl2溶液干預(yù)72h,同時(shí)采用100ng/ml的BDNF分別干預(yù)24h、48h、72h和96h;采用125μmol/L的CoCl2溶液干預(yù)72h的Mǖller細(xì)胞為缺氧對(duì)照組;不

9、加CoCl2溶液及BDNF的Mǖller細(xì)胞為正常對(duì)照組。采用RT-PCR方法檢測(cè)Mǖller細(xì)胞GLAST及GS mRNA的表達(dá):采用Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)Mǖller細(xì)胞GLAST蛋白質(zhì)的表達(dá);采用L-[3,4-H3]-谷氨酸檢測(cè)CoCl2溶液缺氧干預(yù)組與正常對(duì)照組Mǖller細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取功能的差異;采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：與缺氧對(duì)照組及

10、正常對(duì)照組相比,CoCl2缺氧干預(yù)后加入BDNF干預(yù)各組(24h、48h、72h),GLAST及GS的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05),其中以CoCl2缺氧干預(yù)72h,BDNF干預(yù)48h組GLAST及GS表達(dá)最強(qiáng)(P＜0.05)。然而,CoCl2缺氧干預(yù)72h,BDNF干預(yù)96h組,GLAST及GS的表達(dá)與缺氧對(duì)照組及正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。CoCl2缺氧干預(yù)后加入BDNF干預(yù)各組(24h、48h、72h)與缺氧對(duì)照組及正常對(duì)照組