電場(chǎng)對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【背景】
　　組織的損傷修復(fù)對(duì)于維持組織正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，在這一過程中，電場(chǎng)可能發(fā)揮著不容忽視的作用。當(dāng)上皮細(xì)胞層受到破壞時(shí)，跨細(xì)胞層的離子流驅(qū)動(dòng)電流流出，形成局部?jī)?nèi)源性電場(chǎng)。已證實(shí)多種細(xì)胞能夠在與這種內(nèi)源性電場(chǎng)大小相當(dāng)?shù)耐饧又绷麟妶?chǎng)中呈現(xiàn)生物學(xué)特性的變化，尤其以移行能力的變化最為顯著。研究顯示，多種屬、多組織來(lái)源的細(xì)胞在電場(chǎng)作用下可出現(xiàn)向陰極或陽(yáng)極方向的定向移行，即具有趨電性；電場(chǎng)可明顯促進(jìn)皮膚、角膜上皮損傷的修復(fù)。因此，

2、電場(chǎng)可能作為細(xì)胞移行的重要刺激因素參與損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)。
　　目前關(guān)于電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞作用的機(jī)制仍處于探索中，一些研究認(rèn)為細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞膜表面生長(zhǎng)因子受體的不對(duì)稱分布、相關(guān)第二信使的激活均可能參與其中。在另一方面，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(cell-extracellularmatrix,ECM)間的粘附和相互作用是移行過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而整合素家族在該過程中至關(guān)重要。整合素是細(xì)胞表面兼具粘附和信號(hào)傳導(dǎo)功能的受體，通過胞外域與ECM、胞內(nèi)域與

3、信號(hào)傳導(dǎo)分子結(jié)合，介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)外之間的雙向信號(hào)傳導(dǎo)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、遷移、增生、分化等方面發(fā)揮重要作用。局部粘附激酶(focaladhesionkinase,FAK)是細(xì)胞內(nèi)一種非受體型酪氨酸激酶，是整合素介導(dǎo)的胞外-胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的基礎(chǔ)性信號(hào)傳遞分子。它與整合素受體相連接并聚集其它分子于連接位點(diǎn)，形成信號(hào)復(fù)合體，將細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞骨架傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、移行。PTEN(phosphataseandtensinhomologuede

4、letedonchromosome10)為一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，能對(duì)FAK及其信號(hào)通路中多種信號(hào)分子進(jìn)行脫磷酸調(diào)節(jié)，影響其正常細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞局部粘附和運(yùn)動(dòng)遷移功能受到抑制。了解整合素及其相關(guān)信號(hào)通路在電場(chǎng)中的變化情況有望為深入理解電場(chǎng)作用的機(jī)制開辟新領(lǐng)域。
　　視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)位于視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞與Bruch膜之間，是維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，RPE損傷

5、相關(guān)的病變可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失。然而RPE細(xì)胞所處位置的特殊性，使它易于同時(shí)受到神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的雙重影響，同時(shí)由于各種外來(lái)干擾措施不易直接對(duì)其產(chǎn)生作用，因此造成相關(guān)疾病的治療面臨重重困難。
　　在與RPE損傷相關(guān)的疾病中，年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)是患病率較高且危害較大的一種。AMD是50歲以上人群中視力障礙的主要原因，并隨著人口老齡化趨勢(shì)，該疾病的高危人群數(shù)量還

6、在迅速擴(kuò)大。AMD的發(fā)病中，在物質(zhì)代謝異常、細(xì)胞功能變化、遺傳和環(huán)境等因素的共同作用下，黃斑區(qū)脈絡(luò)膜毛細(xì)血管、Bruch膜、RPE和光感受器細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生慢性進(jìn)行性改變。由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前針對(duì)AMD的各種治療措施效果均十分有限。分析AMD的組織病理學(xué)特點(diǎn)，認(rèn)為其治療關(guān)鍵在于促進(jìn)病變區(qū)受損RPE細(xì)胞正常組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。結(jié)合電場(chǎng)在其它組織損傷修復(fù)中的作用，推測(cè)可以將電場(chǎng)引入對(duì)RPE細(xì)胞誘導(dǎo)和AMD治療的研究中來(lái)。
　　【目的

7、】
　　建立電場(chǎng)對(duì)人RPE(hRPE)細(xì)胞的體外作用模型，觀察電場(chǎng)對(duì)hRPE細(xì)胞生物學(xué)活性、移行、增生的影響，并檢測(cè)此過程中整合素、FAK信號(hào)通路的變化以及PTEN基因?qū)ι鲜鐾返恼{(diào)節(jié)作用。
　　【方法】
　　1)原代培養(yǎng)hRPE細(xì)胞，并根據(jù)文獻(xiàn)描述建立電場(chǎng)對(duì)hRPE細(xì)胞的作用模型；細(xì)胞暴露于電場(chǎng)強(qiáng)度為0～10V/cm的電場(chǎng)中，顯微照相系統(tǒng)記錄電場(chǎng)作用前、作用3h及停止作用后12h的細(xì)胞圖像；利用臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)法

8、計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)活細(xì)胞率；細(xì)胞核仁組成區(qū)嗜銀蛋白(AgNORs)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞核內(nèi)AgNORs顆粒數(shù)目；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況。
　　2)觀察電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞移行的影響：hRPE細(xì)胞接受電場(chǎng)作用，選取電場(chǎng)強(qiáng)度分別為2、4、6、8、10V/cm，作用時(shí)間為3h，細(xì)胞分為無(wú)血清培養(yǎng)液組、無(wú)血清培養(yǎng)液+表皮生長(zhǎng)因子(EGF)組、正常培養(yǎng)液組及正常培養(yǎng)液+EGF組。另選取部分正常培養(yǎng)液組細(xì)胞，于6V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度中暴露3h后轉(zhuǎn)換電極方向

9、，繼續(xù)暴露3h。顯微照相系統(tǒng)連續(xù)記錄每15min細(xì)胞圖像，標(biāo)記每個(gè)觀察細(xì)胞核的中心，測(cè)量細(xì)胞移行距離、細(xì)胞移行方向與場(chǎng)線間的夾角，追蹤細(xì)胞位移，用cosineФ描述細(xì)胞移行方向。觀察參數(shù)包括：平均cosineФ、平均移行距離、平均移行速度、實(shí)際移行速度及移行指數(shù)。觀察電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞增生的影響：電場(chǎng)作用條件為6V/cm、12h，計(jì)數(shù)電場(chǎng)作用前后hRPE細(xì)胞的細(xì)胞密度、細(xì)胞生長(zhǎng)速度；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期；采用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c

10、yclinE的表達(dá)情況。
　　3)電場(chǎng)作用條件為6V/cm、3h，細(xì)胞松弛素B作為抑制劑，電場(chǎng)作用前與正常hRPE細(xì)胞共培養(yǎng)30min；免疫熒光染色方法檢測(cè)正常hRPE細(xì)胞和細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞內(nèi)F-actin、β1integrin在電場(chǎng)作用前后的分布情況；RT-PCR、Westernblot方法分別檢測(cè)電場(chǎng)作用前后細(xì)胞內(nèi)β1integrin的mRNA和蛋白含量變化；Westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FAK、pFAK(phosp

11、horylatedFAK)蛋白含量。
　　4)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PTEN的真核表達(dá)載體及其空載體轉(zhuǎn)染hRPE細(xì)胞，經(jīng)G418篩選(濃度為400mg/L)后獲得穩(wěn)定的克隆并進(jìn)行鑒定；挑選細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，接受電場(chǎng)作用，作用條件與第二部分實(shí)驗(yàn)相同；記錄每15min細(xì)胞圖像，標(biāo)記每個(gè)觀察細(xì)胞核的中心，測(cè)量細(xì)胞移行距離、細(xì)胞移行方向與場(chǎng)線間的夾角，追蹤細(xì)胞位移，用cosineФ描述細(xì)胞移行方向；采用流式細(xì)胞儀測(cè)定電場(chǎng)作用前后的細(xì)胞周期；采

12、用Westernblot方法檢測(cè)電場(chǎng)作用前后轉(zhuǎn)染細(xì)胞中FAK、pFAK的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1)成功建立了電場(chǎng)對(duì)hRPE細(xì)胞的作用模型，各電場(chǎng)參數(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好。電場(chǎng)強(qiáng)度小于2V/cm的電場(chǎng)暴露對(duì)hRPE細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯影響。暴露于2～10V/cm的電場(chǎng)后，hRPE細(xì)胞胞體伸長(zhǎng)、細(xì)胞長(zhǎng)軸垂直于場(chǎng)線方向排列；細(xì)胞暴露于電場(chǎng)3h后停止作用，繼續(xù)培養(yǎng)12h，細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)下的多角形或不規(guī)則形。臺(tái)盼藍(lán)和AgNORs染色顯示各

13、電場(chǎng)強(qiáng)度下各組細(xì)胞平均活細(xì)胞率和AgNORs顆粒數(shù)無(wú)顯著差別(P>0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，電場(chǎng)作用前后hRPE細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。
　　2)未受電場(chǎng)作用的正常對(duì)照組細(xì)胞隨機(jī)分布，平均cosineФ值為0.02±0.10。電場(chǎng)作用后，hRPE細(xì)胞出現(xiàn)朝向電場(chǎng)陰極方向的定向移行，此現(xiàn)象隨電場(chǎng)作用時(shí)間的延長(zhǎng)和電場(chǎng)強(qiáng)度的升高更為明顯，平均cosineФ值持續(xù)增大并趨近于1。血清能夠影響hRPE細(xì)胞在電場(chǎng)中的定向移行。無(wú)血清

14、培養(yǎng)液組中，電場(chǎng)強(qiáng)度低于6V/cm時(shí)細(xì)胞無(wú)明顯的形態(tài)及移行變化，在6V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度中方出現(xiàn)朝向垂直于場(chǎng)線方向的轉(zhuǎn)位及微弱的陰極方向位移，平均cosineФ值為0.21±0.13。正常培養(yǎng)液組中，6V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度中細(xì)胞出現(xiàn)明顯的陰極方向移行趨勢(shì)，平均cosineФ值為0.63±0.04，并隨電場(chǎng)強(qiáng)度升高而增強(qiáng)，該組細(xì)胞各電場(chǎng)強(qiáng)度下移行分布指標(biāo)均高于無(wú)血清組(P<0.001)。EGF可增強(qiáng)hRPE細(xì)胞對(duì)電場(chǎng)作用的反應(yīng)，在同時(shí)有血清存在時(shí)

15、此作用更為明顯。無(wú)血清組培養(yǎng)液中加入EGF后，在4V/cm電場(chǎng)中細(xì)胞平均cosineФ值為0.35±0.09，隨電場(chǎng)強(qiáng)度的增高，此定向移行逐漸增強(qiáng)。細(xì)胞培養(yǎng)液中同時(shí)加入血清和EGF后，hRPE細(xì)胞在各電場(chǎng)強(qiáng)度中移行分布指標(biāo)均較無(wú)血清組和正常培養(yǎng)液組升高。hRPE細(xì)胞移行方向隨電極方向轉(zhuǎn)換而改變，表現(xiàn)為始終朝向電場(chǎng)陰極一側(cè)運(yùn)動(dòng)。對(duì)細(xì)胞增生情況的觀察結(jié)果顯示，電場(chǎng)作用12h后hRPE細(xì)胞密度和生長(zhǎng)速度均較對(duì)照組上升，組間差異顯著(P<0.0

16、5)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例下降，S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯增多，與對(duì)照組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Westernblot結(jié)果表明電場(chǎng)作用下細(xì)胞內(nèi)cyclinE的蛋白量較對(duì)照組升高。
　　3)免疫熒光染色結(jié)果顯示，正常hRPE細(xì)胞內(nèi)F-actin在胞漿成網(wǎng)狀分布；電場(chǎng)作用3h后actin纖維束向細(xì)胞周邊聚集，尤其是朝向電場(chǎng)陰極一側(cè)；β1integrin在正常hRPE細(xì)胞內(nèi)有弱表達(dá)，電場(chǎng)作用3h之后

17、熒光強(qiáng)度明顯升高并集中于細(xì)胞朝向電場(chǎng)陰極的一側(cè)。細(xì)胞松弛素B預(yù)處理細(xì)胞內(nèi)F-actin和β1integrin均形成散在分布于胞漿內(nèi)的點(diǎn)狀沉積物，電場(chǎng)作用后未見有明顯變化。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，電場(chǎng)作用后β1integrin的mRNA和蛋白表達(dá)均升高，該現(xiàn)象可被細(xì)胞松弛素B抑制。FAK蛋白在hRPE細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，各組間未見顯著性差異。pFAK在未受電場(chǎng)作用的細(xì)胞中有微弱表達(dá)，電場(chǎng)作用后表達(dá)迅速、持續(xù)上升，兩組間差別顯著(P<0.05

18、)。
　　4)PTEN基因被成功轉(zhuǎn)染入hRPE細(xì)胞，轉(zhuǎn)染有PTEN的hRPE細(xì)胞在電場(chǎng)作用前后細(xì)胞形態(tài)和移行均未發(fā)生明顯變化，正常對(duì)照組細(xì)胞在10V/cm電場(chǎng)作用3h后平均cosineФ值為0.78±0.02，PTEN轉(zhuǎn)染細(xì)胞降至0.19±0.02，組間差異顯著(P<0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，PTEN轉(zhuǎn)染后G1期細(xì)胞百分比上升，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量下降，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)；6V/cm電場(chǎng)作用12h后

19、，細(xì)胞周期的上述表現(xiàn)無(wú)明顯變化(P>0.05)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，hRPE細(xì)胞中FAK蛋白的總水平在PTEN轉(zhuǎn)染和電場(chǎng)作用前后均無(wú)顯著變化；電場(chǎng)作用后細(xì)胞pFAK的蛋白量明顯升高，PTEN轉(zhuǎn)染則抑制了該現(xiàn)象，表現(xiàn)為僅有微弱的蛋白表達(dá)。
　　【結(jié)論】
　　1)短時(shí)間、低于10V/cm的電場(chǎng)作用對(duì)hRPE細(xì)胞的正?；盍胺至褵o(wú)明顯不良影響，保證了進(jìn)一步體外和在體實(shí)驗(yàn)的安全性。
　　2)電場(chǎng)作用能夠引導(dǎo)hR

20、PE細(xì)胞的定向移行，該作用與電場(chǎng)強(qiáng)度、血清和生長(zhǎng)因子有關(guān)；一定時(shí)間內(nèi)電場(chǎng)作用能夠通過上調(diào)cyclinE的表達(dá)促進(jìn)hRPE細(xì)胞的增生。
　　3)電場(chǎng)對(duì)hRPE細(xì)胞的作用可引起細(xì)胞骨架蛋白的聚合反應(yīng)，進(jìn)而觸發(fā)整合素及整合素相關(guān)信號(hào)通路FAK的活化，說明電場(chǎng)作用至少部分的通過整合素及FAK信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　4)PTEN轉(zhuǎn)染能夠明顯抑制hRPE細(xì)胞在電場(chǎng)作用后的移行、增生能力及FAK信號(hào)通路的活化，說明PTEN通過調(diào)節(jié)FAK信