結核分支桿菌H37Rv與H37Ra的差異表達基因研究.pdf

1、目的：構建結核分支桿菌H37Rv與H37Ra的差異表達基因消減文庫,分離結核分支桿菌差異表達cDNA片段并分析其功能,篩選出致病株獨有的保護性抗原編碼基因,借助質粒載體將其表達于人類口腔非致病性黏膜共生菌戈登氏鏈球菌表面,為構建新型結核黏膜疫苗打下基礎。本研究分為五部分：結核分支桿菌培養(yǎng)；結核分支桿菌RNA抽提及純化；抑制性消減雜交；cDNA消減文庫的構建；消減文庫的擴增及鑒定及測序。
　　 方法：⑴利用法國梅里埃公司BacT

2、ALERT()MP處理系統(tǒng)對結核分支桿菌強毒株H37Rv和弱毒株H37Ra進行快速液體培養(yǎng)。⑵按Trizol試劑盒及TaKaRa公司PCR Product Purification Kit說明書操作進行結核分支桿菌RNA抽提及純化。⑶利用抑制性消減雜交技術分析結核分支桿菌強毒株H37Rv和弱毒株H37R的基因組mRNA的表達差異,并進行兩輪消減雜交和兩次PCR。⑷:將第二次PCR產物與pGEM-T載體相連,電擊轉化大腸桿菌coli DH

3、5a,離心轉化產物,取沉淀涂于藍白斑篩選平板,構建正相和反相消減文庫A庫和B庫。⑸隨機挑取A庫和B庫白色菌落作為RT-PCR模版進行文庫擴增和藍白斑篩選,RT-PCR鑒定差異表達文庫。⑹隨機挑選含有插入序列的陽性克隆送上海生工測序并進行序列分析。所得測序結果通過NCBI提供的Blast軟件與GenBank收錄的序列進行同源性比較,查閱文獻,分析結果。
　　 結果：以結核分支桿菌強毒株H37RV的cDNA為檢測子的正相雜交和以弱毒

4、株H37Ra的cDNA為檢測子的反相雜交各自高表達或特異性表達的片斷都得到選擇性擴增,成功構建了差異表達cDNA文庫A庫和B庫。所長出的菌落中90％為白色克隆,其中A庫單一條帶的克隆為75％,B庫為80％,片斷大小集中在100-800bp之間。分別從A庫和B庫中各自篩選出一批克隆,送上海生工進行測序,正相雜交篩選到11個特異性序列,反相雜交未篩選到特異性序列:其中1個為PPE家族蛋白,1個編碼已知的毒力因子mce蛋白,1個存在6000早

5、期分泌抗原(ESAT-6)的基因序列,1個編碼膜蛋白,6個分別編碼亮氨酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、短鏈還原酶、核糖核苷二磷酸還原酶、甲基分支菌酸合酶、異亮氨酰-tRNA合成酶,1個為可能蛋白。其中PPE、ESAT-6為結核分支桿菌的保護性抗原。
　　 結論：利用SSH技術成功構建了結核分支桿菌強毒株H37Rv和弱毒株H37Ra差異表達基因消減cDNA文庫,并篩選到這兩種菌株間的差異基因。SSH用于比較強毒、弱毒微生物基因組間差異進