斑蝥素間接競爭性ELISA檢測方法的建立及眼斑鞠菁體內(nèi)斑蝥素的免疫熒光檢測.pdf

1、眼斑芫菁(Mylabris Cichorii Linnaeus)，又稱為黃黑小斑蝥，是鞘翅目芫菁科昆蟲，也是傳統(tǒng)的中藥動物藥?，F(xiàn)代的臨床學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，眼斑芫菁在治療癌癥和一些疑難雜癥方面具有獨特效果，其抗癌有效成分就是斑蝥蟲體所含的斑蝥素。到目前為止，對于眼斑芫菁體內(nèi)的斑蝥素的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布等方面的研究和相關(guān)報道很少，對其生物合成和代謝機(jī)制的研究更是有限。
　　 對于斑蝥素的檢測方法，國內(nèi)外早期是采用重量法和酸堿滴定法。近年來，又發(fā)展

2、出更加精確的氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法以及反相高效液相色譜法等方法。但是這些方法所需的儀器本身價格比較昂貴，且操作復(fù)雜，需要專業(yè)的技術(shù)手段，因此只能應(yīng)用于實驗室的檢測。
　　 酶聯(lián)免疫吸附劑測定法因其靈敏度較高、特異性良好、檢測便捷且周期短、成本低廉，廣泛的應(yīng)用于蛋白類生物大分子的檢測。早期對于缺乏免疫原性的小分子物質(zhì)，由于不能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，所以對于小分子物質(zhì)的檢測主要還是依賴于色譜分析，近年來，研究者將小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)大分

3、子結(jié)合，合成小分子物質(zhì)完全抗原的方法，獲得小分子物質(zhì)的抗體，使得利用免疫學(xué)方法檢測小分子物質(zhì)成為可能。
　　 本研究的目的主要就是建立快速、靈敏的斑蝥素的間接競爭ELISA檢測方法，并對其檢測結(jié)果進(jìn)行評價，為進(jìn)一步研制斑蝥素檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。同時利用獲得的斑蟊素抗體，以免疫熒光檢測的方法研究斑蝥素在眼斑芫菁成蟲體內(nèi)的分布，為進(jìn)一步研究斑蝥素的合成機(jī)制以及芫菁科昆蟲體內(nèi)斑蝥素的代謝途徑等提供有力的支持。研究已經(jīng)取得如下主要結(jié)果：

4、
　　 ①利用已制備的斑蝥素完全抗原，經(jīng)動物免疫獲得多克隆抗體。經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化，建立了斑蝥素的間接競爭性ELISA檢測方法。優(yōu)化后的檢測體系為：用含CA-OVA的PBS(pH7.4)包被液包被酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃孵育過夜。在酶標(biāo)板中加入封閉液1％明膠(200μl/孔)，置37℃孵育2h。同時加入用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋的斑蝥素標(biāo)準(zhǔn)品和按1:200稀釋的一抗各50μl/孔，37℃下孵育1h，使固定抗原CA-OVA與斑蝥

5、素競爭性地結(jié)合一抗。加入HRP酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(用PBS緩沖液1:5000進(jìn)行倍數(shù)稀釋)，100μl/孔，37℃下孵育1h。加入配好的OPD顯色液，100μl/孔，于37℃下遮光孵育15min。加入反應(yīng)終止液體2M濃硫酸，50μl/孔。最后置于酶標(biāo)儀中，在492nm波長處讀數(shù)。
　　 在此檢測體系下，對斑蝥素的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-13.421x+102.45，R2=0.988，檢測范圍為：0.1μg/ml～24μg/ml

6、。其最低檢測下限為0.01μg/ml，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為4.27％和4.56％，檢測效果良好。
　　 ②對眼斑芫菁25日齡成蟲經(jīng)組織解剖，然后進(jìn)行免疫熒光染色，進(jìn)而利用熒光顯微鏡對眼斑芫菁雌、雄成蟲性腺各部分、生殖附腺、消化道等主要器官系統(tǒng)中熒光強(qiáng)度進(jìn)行觀察，并利用IPP6.0檢測數(shù)據(jù)和DPS分析。結(jié)果顯示，在雌蟲體內(nèi)各器官組織中，生殖系統(tǒng)的平均熒光強(qiáng)度要顯著性的高于腸道系統(tǒng)，而生殖系統(tǒng)內(nèi)以儲精囊的平均熒光強(qiáng)度為最高。雄蟲

7、體內(nèi)生殖腺和腸道系統(tǒng)以及精巢之間在平均光密度方面存在顯著性差異，而腸道系統(tǒng)和精巢在平均光密度值方面不存在顯著差異。整個蟲體內(nèi)的組織器官中，以精巢的平均光密度值為最高。雄蟲的腸道系統(tǒng)在平均光密度值方面顯著的高于雌蟲腸道系統(tǒng)，而在生殖系統(tǒng)的比較中，雄蟲的平均光密度值也要高于雌蟲，但是不存在顯著性差異。由此可以推測，眼斑芫菁成蟲其主要的斑蝥素儲存部位位于生殖系統(tǒng)，同時由雌蟲儲精囊中光密度值的高表達(dá)也可以確信，其體內(nèi)的斑蝥素主要是來自于雄蟲，是