Gankyrin蛋白在大鼠肝細(xì)胞癌微轉(zhuǎn)移中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌，HepatocellularCarcinoma，HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的高發(fā)腫瘤之一，具有難以早期發(fā)現(xiàn)、血行轉(zhuǎn)移早、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等特點(diǎn)，其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移是由體內(nèi)多基因參與、多步驟協(xié)同的復(fù)雜過(guò)程。 目前，盡管已經(jīng)鑒定了一些肝癌的抑癌基因，如p53和p16等，并明確了它們?cè)诟伟┲械奶禺愋允Щ睿窃诟伟┌l(fā)生中特異性激活的癌基因卻少見(jiàn)報(bào)道。Gankyrin基因(Gannankyrinrepeatedgene)是

2、新近克隆的一個(gè)在肝癌中高表達(dá)的癌基因，其致癌性可能與其的表達(dá)產(chǎn)物Gankyrin蛋白通過(guò)高磷酸化并降解抑癌蛋白R(shí)b，致使Rb蛋白失活，進(jìn)而促使細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化有關(guān)。Gankyrin蛋白在肝癌中呈陽(yáng)性表達(dá)，并隨肝癌的進(jìn)展其表達(dá)越來(lái)越強(qiáng)。 雖然近年來(lái)在肝癌的治療方面取得了許多進(jìn)展，但外科手術(shù)切除和肝移植仍然是最有效的手段，盡管實(shí)施了根治性的切除術(shù)或肝移植，由于不能檢測(cè)到的外周血中的微轉(zhuǎn)移，很多病人仍死于肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。近

3、年來(lái)，利用分子生物學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)遠(yuǎn)處器官、外周血中孤立的腫瘤細(xì)胞或微轉(zhuǎn)移已經(jīng)為研究肝癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為開(kāi)辟了新的途徑。利用高敏感性的巢氏RT-PCR方法檢測(cè)外周血中的孤立的腫瘤細(xì)胞可能有助于提高微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的敏感性和特異性。 目的：檢測(cè)Gankyrin蛋白(Gannankyrinrepeatedprotein)在Wistar大鼠肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展不同階段中的表達(dá)。檢測(cè)Rb蛋白(Retinoblastomaprotein)在Wist

4、ar大鼠肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展不同階段中的表達(dá)。探討Gankyrin蛋白和Rb蛋白在Wistar大鼠肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的相互關(guān)系。探討在Wistar大鼠肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞表達(dá)與Gankyrin蛋白和Rb蛋白的關(guān)系，檢測(cè)微轉(zhuǎn)移的敏感性和特異性及其對(duì)于預(yù)測(cè)其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的意義。 方法：應(yīng)用二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)Wistar大鼠肝細(xì)胞癌，MRI動(dòng)態(tài)掃描大鼠肝臟成瘤情況，并分別在誘導(dǎo)第16、18、20、22、25周處

5、死大鼠。留取肝臟標(biāo)本動(dòng)態(tài)觀(guān)察病理變化，免疫組化法動(dòng)態(tài)檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中Gankyrin蛋白、Rb蛋白的表達(dá)情況。提取大鼠總外周血約10ml，通過(guò)巢氏RT-PCR技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)外周血中AFPmRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：應(yīng)用DEN成功誘導(dǎo)出Wistar大鼠肝細(xì)胞癌模型，誘癌率為71.7％(86/120)。大鼠在誘導(dǎo)16周以前主要以肝硬化為主，誘導(dǎo)17-22周以肝細(xì)胞癌為主，誘導(dǎo)23周及以后多出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。大鼠肝細(xì)胞癌病理分級(jí)可分為

6、高分化、中分化及低分化三級(jí)，本組例數(shù)分別為35、29、22例。大鼠肝細(xì)胞癌共出現(xiàn)轉(zhuǎn)移18例，轉(zhuǎn)移率為20.9％(18/86)。 Gankyrin蛋白在惡性肝細(xì)胞中特異性表達(dá)，其在伴轉(zhuǎn)移肝癌組、未轉(zhuǎn)移肝癌組、肝硬化組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別是94.4％(17/18)、67.6％(46/68)、14.3％(3/21)和0.0％(0/20)，相差非常顯著(P＜0.01)。 Rb蛋白在正常肝細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)。其在伴轉(zhuǎn)移肝癌

7、組、未轉(zhuǎn)移肝癌組、肝硬化組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別是16.7％(3/18)、54.4％(37/68)、85.7％(18/21)和100.0％(20/20)，相差非常顯著(P＜0.01)。 Pearson相關(guān)性分析Gankyrin蛋白和Rb蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。肝硬化組中r=-0.611，P＜0.01；未轉(zhuǎn)移肝癌組中r=-0.444，P＜0.01;伴轉(zhuǎn)移肝癌組中r=-0.542，P＜0.05。 AFPmRNA在伴轉(zhuǎn)

8、移肝癌組、未轉(zhuǎn)移肝癌組、肝硬化組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的外周血陽(yáng)性表達(dá)率分別是81.8％(9/11)、42.3％(22/52)、6.3％(1/16)和0.0％(0/20)，相差非常顯著(P＜0.01)。 Pearson相關(guān)性分析Gankyrin蛋白和AFPmRNA的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。肝硬化組中r=0.683，P＜0.01；未轉(zhuǎn)移肝癌組中r=0.287，P＜0.05；伴轉(zhuǎn)移肝癌組中r=0.671，P＜0.05。用McNemar雙側(cè)精確概率

9、法分析兩法檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性差異，p=1.000。 Pearson相關(guān)性分析Rb蛋白和AFPmRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。肝硬化組中r=-0.806，P＜0.05；未轉(zhuǎn)移肝癌組中r=-0.413，P＜0.01；伴轉(zhuǎn)移肝癌組中r=-0.671，P＜0.05。用McNemar雙側(cè)精確概率法分析兩法檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性差異，P=1.000(肝癌未轉(zhuǎn)移組中P=0.324)。 結(jié)論：Gankyrin蛋白在肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中發(fā)揮重要的促癌作

10、用，并且可能與肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 Gankyrin蛋白的過(guò)表達(dá)和/或Rb蛋白的失表達(dá)在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中可能有協(xié)同作用。 Gankyrin蛋白和Rb蛋白有可能成為肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移早期監(jiān)測(cè)的參考指標(biāo)。 以AFPmRNA為標(biāo)志物，通過(guò)巢氏RT-PCR來(lái)檢測(cè)肝細(xì)胞癌外周血微轉(zhuǎn)移是可行的，早期檢測(cè)外周血微轉(zhuǎn)移可以提高預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的能力。 肝細(xì)胞癌的外周血微轉(zhuǎn)移可能與Gankyrin蛋白的過(guò)