腫瘤微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、目的：
　　 明確作為腫瘤治療載體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stemcells，MSCs）在腫瘤微環(huán)境中是否受到其中的細(xì)胞因子、信號(hào)分子及細(xì)胞間相互作用的影響而自身發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)是否能夠形成腫瘤，進(jìn)而為MSCs進(jìn)行修飾以規(guī)避其瘤化的危險(xiǎn)性，使其更加安全地應(yīng)用于臨床提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)：取Wistar大鼠的股骨和脛骨骨髓，貼壁篩選法體外分離

2、、培養(yǎng)、擴(kuò)增MSCs；C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞采用與MSCs相同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組：本實(shí)驗(yàn)分體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)設(shè)為兩組即對(duì)照組（單獨(dú)培養(yǎng)的MSCs），實(shí)驗(yàn)組（間接共培養(yǎng)組：transwell插入式培養(yǎng)皿結(jié)合6孔板構(gòu)建MSCs和C6細(xì)胞共培養(yǎng)體系；直接共培養(yǎng)組：GFP腺病毒標(biāo)記MSCs后加入C6細(xì)胞共同培養(yǎng)）；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分三組：陰性對(duì)照組（體外單獨(dú)培養(yǎng)的MSCs注入裸鼠體內(nèi)），陽(yáng)性對(duì)照組（C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞注入裸鼠體

3、內(nèi)），實(shí)驗(yàn)組（與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)后的MSCs注入裸鼠體內(nèi)）。
　　 3.實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1）共培養(yǎng)過(guò)程中倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　 2）根據(jù)細(xì)胞周期的改變及核干細(xì)胞因子（necleostemin，NS）的表達(dá)變化檢測(cè)細(xì)胞增值力的改變。
　　 3）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中抑癌基因p53mRNA和癌基Dqmdm2 mRNA的變化。
　　 4）免疫熒

4、光法和westernblot分析突變型p53蛋白和mdm2蛋白的表達(dá)變化。
　　 5）常規(guī)染色體及G顯帶核型分析方法檢測(cè)培養(yǎng)后兩組細(xì)胞的染色體的改變。
　　 6）免疫熒光法檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其腫瘤特異的膠質(zhì)纖維酸蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）在細(xì)胞中的定位及表達(dá)。
　　 7）與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外共培養(yǎng)發(fā)生轉(zhuǎn)化的MSCs植入裸鼠皮下，連續(xù)觀察其裸鼠形體的變化，4周、

5、8周后取材，組織病理檢測(cè)細(xì)胞的存活轉(zhuǎn)化及腫瘤形成，免疫組化檢測(cè)形成的組織中GFAP蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1）利用貼壁篩選法獲得的MSCs的純度較高，第4代的MSCs形態(tài)均一，細(xì)胞扁平，成纖維細(xì)胞樣，分布均勻，排列有序。與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)7d后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，胞質(zhì)向胞核周?chē)湛s，細(xì)胞變細(xì)變長(zhǎng)，胞核變小，類似于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞樣的形狀。
　　 2）流式細(xì)胞周期檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例

6、降低，S期比例升高，兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（p>0.05）；NS蛋白的表達(dá)兩組間無(wú)顯著差異。
　　 3）定量PCR結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組p53 mRNA表達(dá)降低，是對(duì)照組的0.24倍（p<0.01），而mdm2 mRNA表達(dá)升高，是對(duì)照組的3.18倍（p<0.01）；免疫熒光及westernblot結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞中表達(dá)突變型p53蛋白，而對(duì)照組無(wú)該蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組mdm2癌蛋白高度擴(kuò)增，與對(duì)照組比較p<0.05。
　　 4）染色

7、體核型分析結(jié)果為對(duì)照組細(xì)胞染色體眾數(shù)是42，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞染色體變動(dòng)于38到42條之間，其中41條染色體所占比例為33％，說(shuō)明共培養(yǎng)后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞染色體數(shù)目出現(xiàn)非整倍體的改變，G顯帶未見(jiàn)明顯的核型改變。
　　 5）免疫熒光結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組幾乎所有細(xì)胞表達(dá)GFAP蛋白，而對(duì)照組僅為13％，兩組比較p<0.05。
　　 6）以注射的方式將體外培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的MSCs植入裸鼠皮下，4-8周后大體標(biāo)本可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組植入?yún)^(qū)新生物形成，取新生組織HE