EGFR受體介導(dǎo)肺腫瘤靶向siRNA脂多胺修飾脂質(zhì)體的制備與評(píng)價(jià).pdf

1、目的:旨在構(gòu)建EGFR靶向負(fù)載Survivin-siRNA的Staramine修飾的陽離子脂質(zhì)體(EGFR-PEG-SCLs-siRNA),對其進(jìn)行制劑學(xué)評(píng)價(jià),考察其細(xì)胞毒性、靶向性、體外攝取、攝取機(jī)制以及體外藥效學(xué)評(píng)價(jià),并篩選出沉默效率最高的siRNA鏈等前期工作,為后續(xù)制成干粉吸入劑用于肺部給藥、發(fā)揮藥效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:本文通過油酰氯成酯后,發(fā)生酰胺反應(yīng)得到類脂質(zhì)載體Staramine。另外,在納米載體外,進(jìn)行PEG

2、修飾,最后通過TLC、1H-NMR、FT-IR等手段對各產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。Western blot法篩選出最高沉默效率的Survivin-siRNA鏈。采用乙醇注入法制備脂質(zhì)體,靜電吸附負(fù)載siRNA。通過對其粒徑、Zeta電位、包封率、抗RNase酶穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)對脂質(zhì)體進(jìn)行表征和評(píng)價(jià)。體外評(píng)價(jià)以高表達(dá)Survivin的人源性肺腺癌耐順鉑株A549/DDP細(xì)胞為模型,以MTT法評(píng)價(jià)載體安全性,原子力顯微鏡觀察細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取作用。以市

3、售制劑Lipofectamine-2000作為陽性對照,采用流式細(xì)胞儀考察脂質(zhì)體的攝取,攝取機(jī)制,以及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)體外藥效。
　　結(jié)果:類脂質(zhì)載體Staramine經(jīng)TLC、FT-IR、1H-NMR等手段驗(yàn)證產(chǎn)物合成,經(jīng)1H-NMR計(jì)算純度為87％,DSPE-PEG2000-Mal經(jīng)TLC和1H-NMR手段驗(yàn)證產(chǎn)物合成,經(jīng)1H-NMR計(jì)算純度為86.2％。Western blot法篩選出最高沉默效率為38.40％的Surv

4、ivin-siRNA鏈的。所制備的Staramine修飾的陽離子脂質(zhì)體平均粒徑為(172.7±6.6)nm、Zeta-電位為(+7.78±0.5)mV、包封率為(90.8±0.8)％,粒度均一,且對RNase酶有較好的保護(hù)作用。原子力顯微鏡觀察A549/DDP細(xì)胞通過內(nèi)吞作用攝取脂質(zhì)體,流式細(xì)胞儀結(jié)果表明,EGFR靶向顯著性(p<0.05)提高細(xì)胞攝取,其平均熒光強(qiáng)度是EGFR未修飾的1.4倍。攝取機(jī)制結(jié)果表明,細(xì)胞攝取脂質(zhì)體是一個(gè)能量

5、依賴的過程,主要通過網(wǎng)格蛋白以及小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞。細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EGFR-PEG-SCLs-siRNA組的凋亡率為(41.19±1.83)％,明顯高于Lipofectamine-2000組的(21.03±1.37)％。
　　結(jié)論:本文制備的EGFR靶向負(fù)載Survivin-siRNA的Staramine修飾的陽離子脂質(zhì)體(EGFR-PEG-SCLs-siRNA)粒徑均一穩(wěn)定,EGFR靶向顯著提高細(xì)胞攝取率。網(wǎng)格蛋白和小