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文檔簡介
1、本論文對家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovims,BmNPV)的某些功能基因進行了更為深入的研究。首先確定了BmNPVlef-7基因精確的翻譯和轉(zhuǎn)錄起始位點,對gp64基因進行了表達和抗體制備,構(gòu)建了缺失chiA的BmNPVBactoBac表達系統(tǒng)并對外源基因進行了表達。同時,對傳染性胰壞死病病毒(IPNV)的重要功能基因VP2進行了研究。主要結(jié)果如下: 1.BmNPVlef-7基因轉(zhuǎn)錄和翻
2、譯起始位點的鑒定 BmNPVlef-7基因與病毒DNA復制及晚期、極晚期基因的表達有關(guān)。序列分析表明,BmNPVlef-7基因編碼區(qū)的5’端比苜蓿丫蚊夜蛾核型多角體病毒(AutographaCalifornianuclearpolyhedrosisvires,AcNPV>的lef-7基因多出45bp核苷酸序列,然后一直到終止密碼子共有42個堿基缺失。在推斷的,lef-7基因起始密碼子下游46bp處還有一個ATG密碼子,并且這兩個
3、ATG密碼子處于同一個開放閱讀框內(nèi)。為了明確BmNPV,lef-7基因的翻譯起始位點是否與AcNPV有所不同,我們對BmNPVlef-7基因的翻譯和轉(zhuǎn)錄起始位點進行了鑒定。首先克隆了從BmNPV,lef-7基因第二個ATG密碼子開始的lef7基因片段,并在大腸桿菌中與GST進行了融合表達,將表達產(chǎn)物純化后免疫家兔制備了其多克隆抗體。同時構(gòu)建了缺失其5’端第一個翻譯起始密碼子ATG開始的¨bp核苷酸序列的BmNPV重組病毒Bmlef7M1
4、一。用制備的抗體LEF-7抗體對BmNPV和Bmlef7M1一感染的家蠶細胞進行Westernblot分析表明二者都能產(chǎn)生一26kDa的特異性條帶,與預計的LEF-7大小相符。共聚焦顯微分析表明,LEF-7在BmNPV和BmlefTMl一感染的細胞中均位于細胞核內(nèi)。以上結(jié)果表明lef-7基因假定的翻譯起始密碼子ATG(位于BmNPV基因組97059nt)對于,lef-7基因的表達可能是非必需的。5'-RACE分析表明,BmNPV和Bml
5、ef7M1一感染細胞中l(wèi)ef-7mRNA都是從位于第二個ATG密碼子(位于BmNPV基因組97014nt)上游26bp、假定的翻譯起始密碼子ATG上游20bp處的ATCATTmotif開始轉(zhuǎn)錄。 2.BmNPVgp64基因的表達 PCR擴增出1593bp的gp64基因,并分別克隆至原核表達載體pET28a和供體質(zhì)粒pFastBacHTa中,在大腸桿菌(Eschechiacoli)BL21和桿狀病毒BactoBac表達系統(tǒng)
6、中分別進行了表達。gp64基因在大腸桿菌表達量約占細菌總蛋白的10﹪,表達產(chǎn)物主要存在于包涵體中,將表達產(chǎn)物割膠回收后免疫家兔制備了高效價的多克隆抗體。用該抗體去檢測昆蟲細胞中g(shù)p64基因的表達產(chǎn)物野生BmNPV感染的家蠶細胞,均產(chǎn)生與預期大小相符的特異性條帶,說明GP64抗體具有較好的特異性,為以后進一步利用pull-down和免疫共沉淀(IP)技術(shù)從家蠶培養(yǎng)細胞總蛋白中分離出與BmNPVGP64囊膜糖蛋白相互作用的蛋白提供了重要的研
7、究基礎(chǔ)。 3.缺失幾丁質(zhì)酶基因的BmNPV-Bacmid的構(gòu)建及外源基因的表達 將egfp基因、BmNPVchiA基因上游1550bp及下游1997bp的片段,依次克隆到pSK+載體中,構(gòu)建缺失chiA基因的轉(zhuǎn)移載體pEGFP△cMA。將轉(zhuǎn)移載體pEGFP△chMDNA和BmNPVBacmidDNA共轉(zhuǎn)染,經(jīng)過兩輪空斑篩選,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHl0B菌株,經(jīng)PCR鑒定得到了egfp基因取代了cMA基因的重組Bacmid,
8、其中chiA基因編碼區(qū)終止密碼子上游497bp的片段被保留。將輔助質(zhì)粒pMON7124轉(zhuǎn)入含重組Bacmid的DHlOB菌株中,得到了能進行外源基因表達的缺失chM基因的Bact0Bac表達系統(tǒng)DHl0BmBac△cMA。在缺失和未缺失chM基因的BactoBac表達系統(tǒng)中對魚傳染性胰壞死病病毒(IPNV)VP2基因的抗原決定區(qū)VP2e分別進行了表達。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示rBmBac-VP2e和rBmBac△chiA-VP2e感
9、染家蠶細胞后與對照相比均無明顯的特異表達條帶,但用抗VP2e多克隆抗體及6×His單克隆抗體對表達產(chǎn)物分別進行Western-blot分析表明,在32kDa位置均出現(xiàn)一明顯條帶,比預期分子量約大了6kDa左右。證明VP2e在重組病毒rBmBac-VP2e和rBmBac△chiA-VP2e感染的細胞中均得到了表達,且表達量無明顯的差異。rBmBac-VP2e和rBmBac△ch/A-VP2e感染的蛹血淋巴均能產(chǎn)生一條約32kDa左右的條帶
10、,與細胞內(nèi)表達產(chǎn)物大小一致,且條帶沒有明顯的差異。 4.IPNVVP2抗原決定區(qū)(VP2e)研究 已知VP2是病毒衣殼蛋白的主要成分,為糖蛋白,中和抗體產(chǎn)生有關(guān)。IPNVAM-98和MABVY-6株系VP2氨基酸序列同源性為88﹪。VP2抗原決定區(qū)(VP2e)同源性為84﹪,共32個氨基酸殘基有差異,占所有差異殘基數(shù)的52﹪。克隆了VP2抗原決定區(qū)645bp的VP2e片段,并在大腸桿菌中與GST進行了融合表達,表達產(chǎn)物分
11、子量為49kDa,SDS-PAGE檢測和薄層掃描表明,融合蛋白表達量約占大腸桿菌細胞總蛋白的25﹪,其中大約90﹪的表達產(chǎn)物以包涵體形式存在。IPNV~P2表達時相分析表明,感染后6h開始檢測到IPNVVP2的前體,同時可以檢測到少量成熟的VP2,在感染后12-24hVP2前體表達量最高,隨著時間的推移直到感染后72h,VP2前體和成熟VP2的水平基本相當。抗IPNVVP2e抗體和抗MABVVP2e抗體檢測到的兩種病毒感染細胞中的VP2
12、條帶基本一致。ELISA分析表明,抗IPNVVP2e抗體對IPNV的特異性比MABV高50﹪左右。兔抗IPNVVP2e抗體能檢測到IPNV的最低病毒滴度為9.8×103PFU/ml。檢測到的MABV滴度為6.31×105PFU/ml。血清中和實驗表明制備的VP2e抗血清能明顯中和IPNV病毒的感染,在10-5稀釋度,即3.15PFU/ml時可以完全中和IPNV病毒的感染,其中和效應(yīng)比未免疫的兔血清高了10倍。 5.IPNVVP2
13、e片段在昆蟲細胞中的表達及亞細胞定位 將已經(jīng)克隆的VP2e片段與綠色增強蛋白(EGFP)基因利用BactoBac表達系統(tǒng)在Tn-581.4細胞中分別進行了融合與非融合表達。未融合EGFP的重組病毒感染的細胞中表達產(chǎn)物在32kDa左右,比預計的VP2e分子量(23kDa)再加上6×His大約26kDa稍大,與BmNPVBactoBac系統(tǒng)中表達產(chǎn)物的大小一致。VP2e在Tn細胞中與EGFP融合表達后在熒光顯微鏡下發(fā)出強烈的綠色熒光
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