DJ-1蛋白對肺癌微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用及其與EGCG防癌的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　 肺癌在形成前經(jīng)歷了一系列形態(tài)學(xué)及分子水平的改變,從正常的支氣管肺泡上皮細(xì)胞演變成為各種形態(tài)學(xué)表現(xiàn)的肺癌是一個復(fù)雜漫長的多階段多步驟的癌變過程,支氣管上皮細(xì)胞增殖/分化的控制失調(diào)是其中的根本原因。在致癌劑如苯并芘促進(jìn)肺部細(xì)胞惡化和促進(jìn)腫瘤成長的過程中,這些對于肺正常細(xì)胞如支氣管上皮細(xì)胞的作用是潛移默化從量變向質(zhì)變惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)行時的。研究表明酚類等抗氧化劑可以拮抗這一作用。人們致力于尋找良好的化學(xué)預(yù)防策略及物質(zhì),干預(yù)致癌

2、物代謝,不使其活化成完成致癌物或者抑制、防止致癌物與細(xì)胞DNA結(jié)合,抑制癌前病變演變成癌或使其逆轉(zhuǎn)成正常細(xì)胞。在本課題組的前期研究中,證實3,4-苯并芘油劑經(jīng)皮肺內(nèi)注射構(gòu)建大鼠肺腫瘤模型是一種簡單可靠的肺腫瘤動物模型的構(gòu)建方法,其中腫瘤的病理組織學(xué)類型以非小細(xì)胞肺癌為主。我們通過二維凝膠電泳獲取未成瘤大鼠3,4-苯并芘注射旁肺組織與成瘤大鼠癌旁肺組織的差異表達(dá)蛋白質(zhì)圖譜,從而篩選大鼠肺組織微環(huán)境中與3,4-苯并芘誘導(dǎo)大鼠原發(fā)肺癌發(fā)生相關(guān)

3、的蛋白質(zhì)點。這些蛋白質(zhì)點是包括DJ-1在內(nèi)的9個質(zhì)點,我們認(rèn)為是與3,4-苯并芘肺內(nèi)注射后未成瘤大鼠抑制肺癌形成相關(guān)的蛋白質(zhì)點。提示腫瘤微環(huán)境中的DJ-1蛋白可以作為化學(xué)預(yù)防治療癌癥的靶點,化學(xué)預(yù)防可以在早期對致癌因素進(jìn)行控制,通過對微環(huán)境中多種細(xì)胞及細(xì)胞因子的干預(yù)而影響腫瘤表型。腫瘤微環(huán)境靶點眾多,從中挑選DJ-1作為分子靶點及尋找其定位細(xì)胞是第一步,弄清微環(huán)境中蛋白分子水平的變化對腫瘤細(xì)胞的影響,從而驗證靶點蛋白及定位細(xì)胞的作用及與

4、綠茶(酚類)肺癌預(yù)防的關(guān)系。
　　 方法：
　　 實驗第一部分,構(gòu)建3,4-苯并芘油劑經(jīng)皮肺內(nèi)注射大鼠肺腫瘤模型,80只7-8周齡雌性SD大鼠,體重180-220g,隨機(jī)分為2組,A組與B組各40只。A組接受3,4-苯并芘-玉米油肺內(nèi)注射,B組接受玉米油肺內(nèi)注射。兩組大鼠采用相同普通飼料飼養(yǎng),以水為飲料。32周處死大鼠,獲取成瘤鼠和未成瘤鼠的苯并芘注射旁肺組織,驗證肺組織抑制肺痛蛋白點DJ-1表達(dá)水平及主要定位細(xì)胞。DJ

5、-1靶向siRNA轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細(xì)胞,從mRNA水平和蛋白水平研究轉(zhuǎn)染后DJ-1基因的表達(dá)下調(diào)的效應(yīng),檢測轉(zhuǎn)染DJ-1靶向siRNA轉(zhuǎn)染HBE細(xì)胞對細(xì)胞增殖及凋亡的影響。實驗第二部分,建立人支氣管上皮細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞的共培養(yǎng)模型,分成三組,A組為單獨腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)組即空白組,B組為未處理的上皮細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)組即對照組,C組為轉(zhuǎn)染靶向DJ-1的siRNA后的上皮細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)組即實驗組。研究各組細(xì)胞生長增殖曲線及細(xì)胞周期凋

6、亡水平及三組的裸鼠移植瘤實驗。第三部分,構(gòu)建3,4-苯并芘油劑經(jīng)皮肺內(nèi)注射大鼠肺腫瘤模型,60只7-8周齡雌性SD大鼠,體重180-220g,隨機(jī)分為2組,A組與B組各30只。均接受3,4-苯并芘-玉米油肺內(nèi)注射,兩組大鼠采用相同普通飼料飼養(yǎng),A組以1％綠茶為飲料,B組以水為飲料。16周處死大鼠,從mRNA水平和蛋白水平比較兩組大鼠苯并芘注射旁肺組織的DJ-1基因表達(dá)差異。用綠茶有效成分(EGCG)處理支氣管上皮細(xì)胞,從mRNA水平和蛋

7、白水平測定上皮細(xì)胞中DJ-1基因表達(dá)的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 成功構(gòu)建3,4-苯并芘油劑經(jīng)皮肺內(nèi)注射大鼠肺腫瘤模型,免疫組化發(fā)現(xiàn)DJ-1主要表達(dá)于上皮細(xì)胞,且組間表達(dá)存在明顯差異,未成瘤組肺組織表達(dá)水平較成瘤組明顯降低。定位苯并芘促進(jìn)肺癌發(fā)生過程中,大鼠肺組織微環(huán)境防癌作用的位于支氣管上皮細(xì)胞的靶點DJ-1蛋白。DJ-1靶向siRNA轉(zhuǎn)染HBE細(xì)胞,能有效的從mRNA水平和蛋白水平下調(diào)DJ-1基因的

8、表達(dá),在一定轉(zhuǎn)染濃度對HBE細(xì)胞的增值及凋亡無明顯影響。第二部分細(xì)胞實驗,C組中肺腺癌細(xì)胞的增殖受到增殖抑制,細(xì)胞周期阻滯及凋亡水平較前2組增高。各組裸鼠移植瘤實驗提示C組與A組的成瘤時間及成瘤體積存在差異,C組腫瘤的平均體積指數(shù)小于A組。第二部分,A組苯并芘注射旁肺組織DJ-1基因mRNA水平和蛋白水平較B組明顯降低。綠茶有效成分(EGCG)能有效地下調(diào)支氣管上皮細(xì)胞中的DJ-1蛋白的表達(dá)水平,并呈一定劑量和時間效應(yīng)。