常染色體顯性遺傳多囊腎病伴發(fā)顱內(nèi)動脈瘤患者PKD1基因突變的篩查.pdf

1、背景與目的:
　　顱內(nèi)動脈瘤(intracrartial aneurysm，ICA)系顱內(nèi)動脈血管壁形成的血管瘤樣病變，一旦破裂便引起蛛網(wǎng)膜下腔出血。而且顱內(nèi)動脈瘤破裂導致的死亡率和致殘率非常高，所以ICA威脅著患者的生命健康，也給家庭和社會也帶來了沉重的負擔。顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生存在著許多影響因素，其環(huán)境因素主要包括：高血壓、抽煙、性別、酗酒、年齡、吸毒、季節(jié)等，前三項風險因素最為重要，也很可能是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用促進了疾病

2、的發(fā)生，但是現(xiàn)在研究顯示，遺傳因素在ICA的發(fā)病中也占據(jù)重要的地位。
　　常染色體顯性遺性多囊腎病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,即：ADPKD)是臨床上最常見的遺傳性疾病之一，ADPKD是單基因遺傳病，其患病率約為1/1000-1/400［1］，大約3/5的患者都存在家族性遺傳史。而且此遺傳病的外顯率高，可達95％以上，80歲以上的攜帶者幾乎均顯示出該病的某些征象。AD

3、PKD具有明顯的遺傳延遲性，其發(fā)病一般主要在中年以后，其病理特點主要表現(xiàn)在雙側(cè)腎臟上，可形成許多大小不等的液性囊腫，伴隨著囊腫的不斷增大，腎臟結(jié)構(gòu)會遭到破壞，隨之腎臟功能也隨之喪失，最終發(fā)展為尿毒癥，腎臟功能衰竭。通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)：大約50%的患者，在60歲左右即會發(fā)展到終末期腎臟功能衰竭階段［2］，所以目前腎臟功能衰竭是臨床成人多囊腎病最常見的死亡原因之一。ADPKD是一種系統(tǒng)性的遺傳性疾病，它的病變主要累及在雙側(cè)腎臟，除此之外還可波

4、及到患者的肝臟、胰腺、脾臟、卵巢及全身心血管等多個系統(tǒng)，如發(fā)生在組織器官，可形成肝囊腫、脾囊腫、胰囊腫、卵巢囊腫和精囊囊腫等等；在全身心血管系統(tǒng)中，在冠狀動脈、顱內(nèi)動脈等動脈處均可形成大小不等的動脈瘤，如若動脈瘤發(fā)生在腹股溝處，患者可導致腹股溝疝，如發(fā)生在心臟瓣膜處，可導致心臟瓣膜異常，如瓣膜關(guān)閉不全等病變。PKD1、PKD2和PKD3基因是國內(nèi)外已經(jīng)報道的、引起ADPKD三種主要受累基因，而從目前研究發(fā)現(xiàn)，PKD1基因是引起ADPKD

5、的最主要致病基因。
　　高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting, HRM）技術(shù)是在國內(nèi)外發(fā)展起的一種新型的遺傳學檢測方法。HRM技術(shù)源于熔解曲線，所以它是在實時熒光定量PCR的基礎上，僅僅是增加改進了一種新型的熒光飽和染料，即：它是利用一種綠色的熒光飽和染料不斷監(jiān)控核酸雙鏈變化情況，隨后通過熔解曲線走形而進行分析。HRM技術(shù)不受突變堿基種類與位點的局限，具有速度快、操作簡便、成本低，靈敏度和特異性高、準確

6、率高和實現(xiàn)真正的閉管操作等優(yōu)點，從而被迅速而廣泛的應用到基因突變掃描，基因分型與序列匹配，甲基化分析，短片段重復序列與RNA編輯等多方領(lǐng)域中。
　　本研究中采用高分辨率熔解曲線（HRM）分析技術(shù)檢測常染色體顯性遺傳多囊腎?。ˋDPKD）及其伴發(fā)顱內(nèi)動脈瘤（ICA）患者的PKD1基因的突變，從而建立一種簡便而又可靠的篩查、檢測PKD1基因突變的方法，分析突變產(chǎn)生的位置和形式，從而進一步推斷其發(fā)病機制，并探討HRM技術(shù)特點，以及其用于

7、臨床ADPKD患者篩查與診斷的可行性。
　　方法:
　　收集整理2013年7月到2014年8月上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院收治的ADPKD患者，所有患者均經(jīng)B超、CT、磁共振血管成像法篩選患有顱內(nèi)動脈瘤的患者，共收集ADPKD伴發(fā)ICA患者32例。采集32例患者術(shù)前清晨空腹外周血4mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,隨后倒入醫(yī)用干紗布上，晾干制成干血痕。常規(guī)酚-氯仿法抽提32例患者的基因組DNA。設計PCR反應和HR

8、M分析所需的引物，對PCR反應條件進行優(yōu)化，并擴增目的基因片段。隨后用HRM法檢測32例ADPKD患者PKD1基因的1到46號外顯子的突變情況，并對HRM結(jié)果中，懷疑為突變的基因樣本進行直接測序驗證，從而確定樣本存在的突變類型。
　　結(jié)果:
　　通過HRM技術(shù)對32例ADPKD伴發(fā)ICA患者的46個外顯子的56個片段區(qū)域進行檢測分析，有4對外顯子引物未得到熔解曲線圖，從獲得的熔解曲線峰形圖中可知，有9例（1、7、8、9、10

9、、16、18、20和28號）患者存在28條異常的熔解曲線，9例患者標本經(jīng)測序法得到證實，均存在PKD1基因的突變。本實驗中共檢出62個位點突變，其突變率為28.13%：62個突變均為點突變，其中錯義突變28種，無義突變1種，同義突變12種。62個突變分布于13個外顯子，其中11和15號外顯子突變最多，均為12例，分別占總突變的19.36%；10號外顯子9例突變，占14.52%；13號外顯子8例突變，占12.90%；5和25號外顯子均存在

10、4例突變，分別占6.45%；29號外顯子3例突變，占4.84%；7、16、23和26號外顯子均存在2例突變，分別占3.23%；27和38號外顯子均存在1例突變，分別占1.61%。直接測序法證實兩種方法的檢測結(jié)果完全一致。
　　結(jié)論:
　　用HRM法能快速、靈敏、準確的檢測出ADPKD患者PKD1基因的突變情況，不僅可以檢測出已知的基因突變，而且可以簡便、快捷的篩查出一些未知的突變。經(jīng)分析得出：新興的HRM技術(shù)具有操作簡便快速