小鼠胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞過(guò)程中Kcnq1、Cdkn1c基因印記變化及其機(jī)理研究.pdf

1、論文分為二章：
　　 第一章：小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞過(guò)程中印記基因Kcnq1、Cdkn1c表達(dá)研究
　　 目的：體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞，觀察誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程中印記基因Kcnq1、Cdkn1c印記變化，探討胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程中表觀遺傳學(xué)的穩(wěn)定性。
　　 方法：
　　 1.從孕小鼠胚胎分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，絲裂霉素C處理第3-5代小

2、鼠胚胎成纖維細(xì)胞制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，在飼養(yǎng)層細(xì)胞上擴(kuò)增培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞株SF1-G細(xì)胞。
　　 2.參照Shi等人的三階段法，定向誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G向胰島樣細(xì)胞分化；細(xì)胞免疫熒光染色和RT-PCR檢測(cè)分化細(xì)胞中胰島細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)。
　　 3.在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的不同階段收集細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)/限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RT-PCR/RFLP)檢測(cè)印記基因Kcnq1、Cdkn1c表達(dá)的親本來(lái)源，分析

3、其印記狀態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1.SF1-G細(xì)胞能在飼養(yǎng)層細(xì)胞上保持未分化狀態(tài)增殖培養(yǎng)。
　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)分化的第三階段，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)胰島細(xì)胞特異性基因的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，分化終末細(xì)胞可表達(dá)胰島細(xì)胞特異性激素蛋白，證實(shí)成功將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞。
　　 3.RT-PCR/RFLP分析結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞印記基因Kcnq1、Cdkn1c從母源單等位基因表達(dá)

4、轉(zhuǎn)變成雙等位基因表達(dá)，出現(xiàn)印記丟失(LOI)，而持續(xù)傳代培養(yǎng)的ES細(xì)胞中Kcnq1、Cdkn1c仍表現(xiàn)為母源單等位基因表達(dá)，即印記保持(MOI)。
　　 結(jié)論：
　　 1.參照Shi等人的方法，我們能將小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為胰島樣細(xì)胞。
　　 2.是誘導(dǎo)分化培養(yǎng)作用，而不是單純的細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程導(dǎo)致印記基因表達(dá)異常，出現(xiàn)印記丟失，即細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程導(dǎo)致了表觀遺傳性狀的不穩(wěn)定。
　　 第二

5、章：小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞過(guò)程中KνDMR1甲基化及Dmnt表達(dá)研究
　　 目的：觀察胚胎干細(xì)胞SF1-G在誘導(dǎo)分化前后印記基因Kcnq1、Cdkn1c印記調(diào)控區(qū)(ICR)差異性DNA甲基化區(qū)KνDMR1的甲基化狀態(tài)，以及分化各階段細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平變化，以探討胚胎干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程中印記基因Kcnq1、Cdkn1c表達(dá)變化的機(jī)理。
　　 方法：
　　 1.重亞硫酸鹽P

6、CR測(cè)序法檢測(cè)分化前后Kcnq1、Cdkn1c基因印記調(diào)控區(qū)KνDMR1的CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)：1)收集未分化的細(xì)胞及誘導(dǎo)分化終末的細(xì)胞，提取基因組DNA，重亞硫酸鹽處理DNA，以特異性引物PCR擴(kuò)增差異性DNA甲基化區(qū)KνDMR1；2)將PCR產(chǎn)物連接到氨芐抗性T載體質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌，用不含氨芐的LB培養(yǎng)基搖菌后均勻涂在氨芐瓊脂糖平板上，次日挑取陽(yáng)性細(xì)菌克隆，用含氨芐的LB培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性細(xì)菌；3)PCR驗(yàn)證細(xì)菌中存在目的片段后，將

7、菌液送送上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)軟件進(jìn)行分析，了解分化前后細(xì)胞的KνDMR1的甲基化狀態(tài)。
　　 2.Westernblot檢測(cè)誘導(dǎo)分化各階段細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt1和Dmnt3b的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.測(cè)序檢測(cè)了KνDMRl區(qū)23個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，在分化前的胚胎干細(xì)胞中，9個(gè)測(cè)序結(jié)果顯示，有4個(gè)表現(xiàn)為1-23個(gè)CpG位點(diǎn)全部甲基化，另外5個(gè)表現(xiàn)為所有CpG位點(diǎn)都未甲基

8、化，即KνDMR1區(qū)的CpG位點(diǎn)表現(xiàn)為全甲基化或全未甲基化，符合印記調(diào)控區(qū)域差異性DNA甲基化區(qū)(DMR)的特點(diǎn)；而在分化后的細(xì)胞中，11個(gè)測(cè)序結(jié)果顯示，其中5個(gè)表現(xiàn)為1-23個(gè)CpG位點(diǎn)全部甲基化，4個(gè)在第18-23個(gè)CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化，而其余CpG位點(diǎn)未甲基化，其余2個(gè)表現(xiàn)為所有CpG位點(diǎn)都未甲基化，提示原來(lái)未甲基化的KνDMR1發(fā)生了甲基化。
　　 2.Westernblot結(jié)果顯示，胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，從第二階段開(kāi)始

9、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt1水平顯著升高；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt3b在第三階段也顯著升高，而同期傳代培養(yǎng)的未分化細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平?jīng)]有明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.誘導(dǎo)分化過(guò)程中印記調(diào)控區(qū)域的差異性DNA甲基化區(qū)KνDMR1的第18-23個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的改變可能與印記基因Kcnq1、Cdkn1c的印記丟失相關(guān)。
　　 2.誘導(dǎo)分化過(guò)程中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平升高，可能介導(dǎo)了KνDMR1區(qū)甲基化狀