雞毒霉形體HS株TM-1和mgc3基因的表位預(yù)測(cè)及原核表達(dá).pdf

1、雞毒霉形體(Mycoplasma gallisepticum，MG)是雞慢性呼吸道疾病的病原菌，世界各地均有MG的感染和流行，雖然不直接引起禽的大規(guī)模死亡，但疾病的慢性、遷延性流行過程可引起產(chǎn)蛋率下降、孵化率降低、出欄期延長(zhǎng)及飼料利用率降低，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 目前MG的診斷方法主要有病原的分離鑒定、血清平板凝集試驗(yàn)、PCR和ELISA等方法，但上述方法由于耗時(shí)或操作復(fù)雜或需要昂貴儀器等缺點(diǎn)，難以在基層推廣應(yīng)

2、用，因此MG新型的快速診斷也成為該病急需解決的問題之一。膠體金免疫層析快速檢測(cè)MG的方法簡(jiǎn)便、快速、直觀，但是研制抗不同抗原表位的單克隆抗體是該方法建立的重要前提。本研究對(duì)MG菌體保護(hù)性蛋白TM-1和mgc3基因的表達(dá)及抗原表位進(jìn)行了探討，旨在為ELISA方法、膠體金免疫層析法快速檢測(cè)方法及基因工程抗原疫苗的研制提供理論依據(jù)，主要展開了以下研究。 1.雞毒霉形體保護(hù)性抗原基因TM-1和mgc3的克隆 參照NCBI收錄的T

3、M-1和mgc3基因序列設(shè)計(jì)引物，以MG基因組為模板，擴(kuò)增出TM-1和mgc3，經(jīng)測(cè)序，所獲得的TM-1基因?yàn)?19bp；mgc3基因?yàn)?186bp。 2.TM-1和mgc3基因序列的分析及抗原表位的預(yù)測(cè) TM-1基因測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中BIAST比對(duì)，與S6株同源性為99％，其中103-134bp和135-166bp為重復(fù)序列，抗原表位及二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)參數(shù)綜合分析，該重復(fù)區(qū)具有強(qiáng)抗原表位活性；與R株有兩個(gè)同源性序

4、列，同源性分別為91％和93％。對(duì)mgc3基因的全基因序列BLAST比對(duì)，得到三條同源性達(dá)99％的序列，此外還有三條序列只與mgc3基因的1-1300bp具有同源性，分別是99％、98％和91％。選取了HS株的mgc3基因1000-3186bp的區(qū)域進(jìn)行抗原表位軟件預(yù)測(cè)，得到1142-1440bp、1704-2169bp、2165-2521bp和2507-2835bp區(qū)域具有較強(qiáng)的抗原活性。它們不僅親水性、表面可及性、抗原性參數(shù)較高，而

5、且每段序列的上下游引物都包含了該區(qū)的所有突變位點(diǎn)；MG-HS株的mgc3基因中還有10個(gè)編碼色氨酸TGA的位點(diǎn)。 3．雞毒霉形體TM-1和mgc3基因抗原表位區(qū)的原核表達(dá)及其活性鑒定 將經(jīng)過分析的含有高免疫活性的目的片段亞克隆到表達(dá)載體pGEX-KG，經(jīng)轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)后獲得表達(dá)蛋白，SDS-PAGE分析表明融合表達(dá)的蛋白分子量分別約為55KDa、37 KDa和44 KDa。Western blot印跡證明表達(dá)蛋白均具有免疫學(xué)