TLR4及其信號(hào)通道在小鼠視神經(jīng)損傷后的作用及機(jī)制研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生問(wèn)題一直是醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題，視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，由于其特殊的生理特性而成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代表。故探討視神經(jīng)損傷后的修復(fù)問(wèn)題，不僅對(duì)視功能的恢復(fù)也對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能的恢復(fù)有著重要意義。目前視神經(jīng)損傷后大量研究集中在如何促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生，抑制或去除抑制神經(jīng)細(xì)胞再生的不利因素，盡管取得了較大成就，但是對(duì)于損傷后神經(jīng)的再生仍存在較多問(wèn)題。大量研究表明，炎癥反應(yīng)在創(chuàng)傷性中樞

2、神經(jīng)損傷后的繼發(fā)性腦損害過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 目前已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、化學(xué)因子、粘附分子等參與炎癥過(guò)程，并加重神經(jīng)損害。但迄今有關(guān)機(jī)理研究仍無(wú)突破性進(jìn)展，尚不能給以有效地臨床指導(dǎo)。且上述炎癥分子均是其下游事件，據(jù)推測(cè)TLR4可能作為炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的急性炎癥反應(yīng)損傷的扳機(jī)點(diǎn)啟動(dòng)這種病理過(guò)程。近年來(lái)，隨著對(duì)

3、革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起器官組織嚴(yán)重炎癥反應(yīng)機(jī)理研究的深入，機(jī)體固有性免疫細(xì)胞(如小膠質(zhì)細(xì)胞)表達(dá)的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)，在炎癥反應(yīng)中的作用和機(jī)理，引人關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)，LPS與TLR4特異結(jié)合，可激活TLR4，引起細(xì)胞活化，通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)理，引起下游多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有性免疫功能，主要由小膠

4、質(zhì)細(xì)胞完成，而炎癥因子的釋放主要是通過(guò)TLR4-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)TLRs也出現(xiàn)在沒(méi)有外源性病原體入侵的情況，TLR4配體除了LPS之外，熱休克蛋白(HSP60、70)，壞死細(xì)胞碎片等也是其配體。而神經(jīng)外傷后，在軸突損傷周?chē)舶l(fā)現(xiàn)HSP60、70的出現(xiàn)。這一結(jié)果提示：和感染一樣，外傷也可能通過(guò)某種機(jī)制，上調(diào)CNS小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4的表達(dá)，在創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷后參與調(diào)控炎癥反應(yīng)。
　　 早于1988年Hash

5、imot等在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)屬于Ⅰ型跨膜蛋白的受體，命名為T(mén)LRs。TLRs是與果蠅Toll蛋白具有同源性的受體蛋白家族，不僅參與果蠅的胚胎發(fā)育過(guò)程，還在成年果蠅的免疫防御中發(fā)揮重要作用。1997年和1998年，Medazhitov和Rock等克隆出了另外一種Toll的同源物，即如今的TLR4蛋白。
　　 最初，TLRs介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答一直被認(rèn)為是促炎的宿主防御應(yīng)答，主要是消滅入侵的病原體，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)。然而研究發(fā)現(xiàn)TLRs也

6、出現(xiàn)在沒(méi)有外源性病原體入侵的情況，例如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)變性疾病。TLRs在CNS中主要在小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活后，TLRs即迅速出現(xiàn)。而研究發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞即被迅速激活。因此，當(dāng)視神經(jīng)損傷后，視網(wǎng)膜、視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4的表達(dá)變化、意義，以及其引起炎癥鏈?zhǔn)狡俨挤磻?yīng)的機(jī)理研究，對(duì)這一系列問(wèn)題的探討，對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)

7、膜及視神經(jīng)繼發(fā)性損害的發(fā)生機(jī)理，制定有效的診斷和治療措施，有重要意義。
　　 現(xiàn)在認(rèn)為，TLR4信號(hào)通道主要包括MyD88依賴(lài)和非依賴(lài)信號(hào)通道(TRIF通道)。而在神經(jīng)損傷后，活化的TLR4具體通過(guò)哪一條信號(hào)通道傳遞，不得而知。有可能通過(guò)TLR4激活的兩條信號(hào)通道在各自介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。
　　 以往的研究認(rèn)為，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是調(diào)控炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱的核心，它受各種

8、物理及生化因子激活，誘導(dǎo)多種炎癥因子和酶等基因的表達(dá)，介導(dǎo)瀑鏈?zhǔn)窖装Y反應(yīng)的形成、發(fā)展及惡化。TLR4是LPS受體，早期識(shí)別侵入體內(nèi)的G-細(xì)菌并通過(guò)LPS-TLR4-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，目前傾向認(rèn)為，TLR4-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一些病理狀態(tài)的發(fā)病基礎(chǔ)。那么，對(duì)于創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷后，發(fā)生的炎癥反應(yīng)是否也主要通過(guò)TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑啟動(dòng)，并產(chǎn)生炎癥因子IL-6，TNF等，介導(dǎo)對(duì)視網(wǎng)

9、膜、視神經(jīng)的炎性損傷，尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 因此，本研究旨在圍繞小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4表達(dá)變化、意義及信號(hào)通道對(duì)炎癥的調(diào)控這一中心問(wèn)題深入展開(kāi)，并明確TLR4在視神經(jīng)損傷后再生修復(fù)中的作用。
　　 方法：本研究利用BALB/c小鼠建立視神經(jīng)損傷模型，通過(guò)免疫組化及western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)TLR4在視神經(jīng)損傷后表達(dá)；通過(guò)對(duì)小鼠視神經(jīng)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的觀察，利用western blot及熒光定量PCR明確TLR4及其信號(hào)通

10、路的部分關(guān)鍵分子在蛋白水平及mRNA水平的表達(dá)及變化趨勢(shì)；通過(guò)對(duì)TLR4基因突變及野生型小鼠視神經(jīng)鉗夾損傷的對(duì)比研究，利用熒光金標(biāo)記RGC觀察其凋亡情況，以及觀察神經(jīng)再生修復(fù)的關(guān)鍵蛋白GAP-43在視神經(jīng)上的表達(dá)變化，明確TLR4在視神經(jīng)損傷后再生修復(fù)中的作用及機(jī)制。通過(guò)以上研究，以此希望為輔助治療視神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　
　　 1、小鼠視神經(jīng)鉗夾傷后視神經(jīng)表達(dá)TL

11、R4，隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)，在視神經(jīng)、視網(wǎng)膜上的表達(dá)逐漸增加，并在2周左右達(dá)到高點(diǎn)，到第3、4周，TLR4的表達(dá)仍處于較高水平。提示TLR4激活在視神經(jīng)損傷后介導(dǎo)的無(wú)菌性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著一定作用。
　　 2、小鼠視神經(jīng)損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞立即被激活，其活化標(biāo)志物Macl表達(dá)在視神經(jīng)和視網(wǎng)膜上急劇增加，其后緩慢降低，并在第3、4周仍維持在較高水平。提示小膠質(zhì)細(xì)胞的活化介導(dǎo)了視神經(jīng)損傷后的無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，且小膠質(zhì)細(xì)胞的活化與TLR4的激活

12、相輔相成。
　　 3、小鼠視神經(jīng)損傷后MyD88分子在視神經(jīng)上的表達(dá)逐漸升高，其蛋白和mRNA在傷后2、3周處于高水平；而TRIF分子在視神經(jīng)上的蛋白和mRNA表達(dá)水平變化不明顯。小鼠視神經(jīng)損傷后，效應(yīng)分子NF-κB和炎性因子IL-6、TNF-α在視神經(jīng)上的表達(dá)逐漸增加，并在傷后2、3周處于高水平。結(jié)果提示小鼠視神經(jīng)損傷后TLR4信號(hào)主要通過(guò)TLR4-MyD88-NF-κB通道傳遞，是視神經(jīng)損傷后產(chǎn)生無(wú)菌性炎癥反應(yīng)的一條重要通道