當(dāng)歸提取物及佛手柑內(nèi)酯對伏立康唑和伊曲康唑體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運的影響.pdf

1、一、目的:
　　 通過建立Caco-2細(xì)胞模型，預(yù)測和篩選與當(dāng)歸提取物及其呋喃香豆素類成分可能發(fā)生相互作用的藥物；研究當(dāng)歸提取物及佛手柑內(nèi)酯對伏立康唑(Voriconazole，VOR)和伊曲康唑(Itraconazole，ITR)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運的影響。初步探討當(dāng)歸提取物及佛手柑內(nèi)酯與 VOR和ITR發(fā)生的相互作用機(jī)制，為臨床安全用藥提供理論基礎(chǔ)。
　　 二、方法:
　　 1 Caco-2細(xì)胞單層模型的建立和確證<

2、br>　　 為了研究當(dāng)歸提取物及佛手柑內(nèi)酯對VOR和ITR體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運的影響，而采用Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)的方法，建立體外Caco-2細(xì)胞單層模型。Caco-2鑒定采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫熒光、熒光黃和普萘洛爾的通透性和跨膜電阻(TEER)的驗證。
　　 2當(dāng)歸提取物及佛手柑內(nèi)酯、VOR和ITR對Caco-2細(xì)胞毒性
　　 采用苯基溴化四氮唑藍(lán)法(MTT)分別考察當(dāng)歸醇提物(Angelicasinensis alcohol

3、extract，AE)、當(dāng)歸水提物(Angelica sinensis aqueousextract，AW)、佛手柑內(nèi)酯(Bergapton，BGT)、VOR和ITR對Caco-2細(xì)胞的毒性，選擇細(xì)胞存活率大于90％的藥物濃度作為非細(xì)胞毒性劑量進(jìn)行下一步細(xì)胞實驗。
　　 3當(dāng)歸提取物及佛手柑內(nèi)酯對VOR體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運的影響
　　 建立HPLC法測定轉(zhuǎn)運和攝取實驗中VOR的濃度，并進(jìn)行方法學(xué)確證。
　　 在建立好的體

4、外Caco-2細(xì)胞單層模型上，考察VOR的雙向跨膜轉(zhuǎn)運，比較不同的藥物合用對VOR雙向轉(zhuǎn)運的差異，單用VOR作為對照組。HPLC測定樣品中VOR的濃度，計算表觀通透系數(shù)Papp和外排率ER。
　　 在常規(guī)培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞中考察細(xì)胞對VOR的攝取實驗，比較不同的藥物合用對VOR在Caco-2細(xì)胞上的攝取的差異，單用VOR作為對照組。HPLC測定樣品中VOR的濃度。
　　 4當(dāng)歸提取物及佛手柑內(nèi)酯對ITR體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運的

5、影響
　　 建立HPLC法測定轉(zhuǎn)運和攝取實驗中ITR的濃度，并進(jìn)行方法學(xué)確證。
　　 在建立好的體外Caco-2細(xì)胞單層模型上考察ITR的雙向跨膜轉(zhuǎn)運，比較不同的藥物合用對ITR雙向轉(zhuǎn)運的差異，單用ITR作為對照組。HPLC測定樣品中ITR的濃度，計算表觀通透系數(shù)Papp和外排率ER。
　　 在常規(guī)培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞中考察細(xì)胞對ITR的攝取實驗，比較不同的藥物合用對ITR在Caco-2細(xì)胞上的攝取的差異，單用

6、ITR作為對照組。HPLC測定樣品中ITR的濃度。
　　 三、結(jié)果：
　　 1.Caco-2細(xì)胞單層模型的建立和確證
　　 Caco-2細(xì)胞在正常條件下生長旺盛，通過對細(xì)胞形態(tài)、免疫熒光、熒光黃和普萘洛爾的通透性和跨膜電阻(TEER)的驗證，均滿足Caco-2細(xì)胞單層模型的要求。可用于研究當(dāng)歸提取物及其有效成分對VOR和ITR的相互作用。
　　 2.當(dāng)歸提取物及佛手柑內(nèi)酯、VOR和ITR對Caco-2細(xì)胞

7、毒性
　　 24小時MTT毒性實驗結(jié)果顯示，AE、AW、BGT、VOR和ITR對Caco-2細(xì)胞的最大無毒濃度分別為250μg·mL-1，250μg·mL-1，30μg·mL-1，40μg·mL-1和50μg·mL-1。分別選擇200μg·mL-1ITR和VOR，5、20μg·mL-1BGT，100、200μg·mL-1AE和AW進(jìn)行下一步研究。
　　 3.當(dāng)歸提取物及佛手柑內(nèi)酯對VOR體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運的影響
　　

8、VOR跨Caco-2細(xì)胞單層模型轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果顯示：與單用VOR對照組相比，VOR_+AW組的外排率明顯增大，VOR+AE組的外排率顯著減小，而VOR+BGT則組無明顯差異。以上4組的外排率ER=Pappba/Pappab≥1.71，提示VOR在轉(zhuǎn)運過程中是主動轉(zhuǎn)運的，可能受其他載體轉(zhuǎn)運。
　　 VOR在Caco-2細(xì)胞中攝取實驗結(jié)果顯示：與單用VOR對照組相比，VOR+BGT和VOR+AE組對VOR在Caco-2細(xì)胞的攝取量無明

9、顯影響，VOR+AW組對VOR在Caco-2細(xì)胞的攝取量顯著降低，兩個劑量間也無明顯差異。說明：在Caco-2細(xì)胞上，AW可顯著降低VOR的攝取量，而BGT和AE無明顯差異，且不受合用藥物劑量的影響。
　　 4.當(dāng)歸提取物及其有效成分對ITR體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運的影響
　　 ITR的轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果顯示：與單用ITR對照組相比，ITR+AW組的外排率明顯增大；ITR+BGT組和ITR+AE組的外排率均明顯減小，且抑制外排率：ITR+

10、BGT組>ITR+AE組。BL->AP方向的表觀滲透系數(shù)倍高于AP->BL方向，并且以上4組的外排率ER=Pappba/Pappab≥1.03，提示ITR在轉(zhuǎn)運過程中是受載體轉(zhuǎn)運的主動轉(zhuǎn)運。
　　 ITR的攝取實驗結(jié)果顯示：與單用ITR對照組相比，ITR+BGT組對ITR在Caco-2細(xì)胞的攝取量顯著增加，ITR+AW組對ITR在Caco-2細(xì)胞的攝取量顯著降低，ITR+AE組對Caco-2細(xì)胞的攝取量無顯著性差異；兩個劑量間無