豬瘟病毒部分基因的克隆及其原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的一種流行廣、高度接觸性的烈性傳染病。盡管許多國(guó)家采取了控制與撲滅豬瘟的措施，但由于目前生豬貿(mào)易全球化和養(yǎng)豬業(yè)集約化，豬瘟迄今仍然是威脅養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)傳染病之一。 隨著豬瘟弱毒疫苗的研制成功和廣泛應(yīng)用，豬瘟從頻繁的大流行轉(zhuǎn)為無規(guī)律的區(qū)域散發(fā)，病程也由急性轉(zhuǎn)為慢性，出現(xiàn)了非典型性豬瘟。發(fā)病對(duì)象主要是妊娠母豬和幼齡仔豬，出現(xiàn)了病毒的持續(xù)感染、妊娠母豬的帶毒綜合癥、母豬繁殖障礙、出生仔豬先天性震顫、免

2、疫豬群也發(fā)生豬瘟等特點(diǎn)。 為了建立一個(gè)準(zhǔn)確快速的診斷方法，分析我國(guó)目前使用的疫苗株的抗原基因是否發(fā)生了變異以及進(jìn)一步建立能夠鑒別感染豬體內(nèi)是否是由疫苗免疫所產(chǎn)生抗體的方法，本研究初步建立了檢測(cè)CSFV的RT-PCR方法、獲得了E2蛋白的抗原決定區(qū)域的基因，并成功構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒。 首先，根據(jù)GenBank中登錄的豬瘟病毒基因組序列和在前人研究成果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，PC：5'-CGGAGGGACTAG

3、CCRTAGTGG-3'，PD：5'-GTACACCGGTTCCTCCACTCCCAT-3'。分別以感染CSFV疫苗株的兔脾、PK-15細(xì)胞、犢牛睪丸細(xì)胞、乳豬原代腎細(xì)胞和乳兔原代腎細(xì)胞以及感染細(xì)胞培養(yǎng)上清為材料抽提總RNA，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)證明以感染兔脾直接抽提的總RNA與收集的PK-15細(xì)胞、犢牛睪丸細(xì)胞的感染上清經(jīng)離心后抽提的總RNA為模板，能夠較好的擴(kuò)增出大小約為326bp的基因片段(記為PCD)且與已登錄的該段基

4、因大小一致。經(jīng)單酶切鑒定，片段中存在預(yù)期的酶切位點(diǎn)。將其連接到PMD18-TVector上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌液PCR和質(zhì)粒PCR鑒定后測(cè)序。序列分析表明，PCD與登錄號(hào)為AF531433、AY805221、AY382481、AF091507和Z46258的弱毒株的同源性分別為99.4％、99.4％、99.1％、98.5％和97.8％；與登錄號(hào)為M31768和AF091661的Brescia強(qiáng)毒株的同源性分別為96.3％和98.5％；與登

5、錄號(hào)為X87939的Alfort/187強(qiáng)毒株的同源性為98.2％。這表明本實(shí)驗(yàn)已成功地?cái)U(kuò)增了目的基因，初步建立了檢測(cè)豬瘟病毒的RT-PCR方法。 其次，根據(jù)GenBank中登錄的CSFV基因組序列及原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對(duì)E2抗原區(qū)域的原核表達(dá)引物，A：5'-CGGAATTCTTAACTAGGGTCTGGAATAGCG-3'，B：5'-GCGTCGACCCACTGGCTCGCCTTTCACA-3'

6、。為了便于基因的克隆與表達(dá)，我們?cè)谝锏?'端添加了酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從感染的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)上清中擴(kuò)增獲得了大小約為703bp的基因片段(記為PE2)，與預(yù)期片段大小一致。經(jīng)單酶切鑒定，片段中亦存在預(yù)期的酶切位點(diǎn)。將其連接到PMD18-TVector上，經(jīng)菌液PCR和質(zhì)粒PCR鑒定后測(cè)序。序列分析表明，PE2核苷酸序列與登錄號(hào)為AF531433、AY805221、AY382481、AF091507、Z462

7、58、M31768、AF091661以及X87939的各株該部分的序列的同源性依次為99.6％、99.4％、99.1％、96.0％、98.9％、89.9％、92.6％、95.6％，堿基的不同隨機(jī)的分布于整個(gè)序列，無堿基的缺失，無堿基的插入；推導(dǎo)的氨基酸的序列同源性分別為100％、99.6％、99.6％、95.3％、99.6％、90.2％、92.3％、96.2％。 最后，為了獲得PE2蛋白為制備單抗等深入研究，我們應(yīng)用DNA重組技