腺苷酸活化蛋白激酶在酒精性肝病中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:酒精性肝病(ALD)是長期大量飲酒所致的肝臟損害性病變,其病理改變包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化。關(guān)于ALD的發(fā)病機(jī)理目前尚不清楚,近年來有人提出以氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為中心的“二次打擊”假說,“第一次打擊”使脂肪合成增加,脂類沉積在肝細(xì)胞,導(dǎo)致脂肪肝,“第二次打擊”涉及氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。乙醇進(jìn)入人體后,代謝為乙醛和乙酸,對肝臟有直接毒性作用,可降低肝臟的抗氧化能力,引起脂質(zhì)過氧化,從而導(dǎo)致肝

2、臟損傷。乙醇氧化過程中,還原型輔酶Ⅰ(NADH)產(chǎn)生增加,抑制三羧酸循環(huán),使肝內(nèi)脂肪代謝障礙,導(dǎo)致脂肪堆積于肝臟中。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)存在于線粒體內(nèi),屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員,由α、β、γ三個(gè)亞基構(gòu)成,α為催化亞基,β和γ為調(diào)節(jié)亞基。AMPK各亞基的組織分布不同,α1分布很廣,α2主要分布在肝臟、骨骼肌和心臟。AMPK的活性受AMP/ATP比值的調(diào)控,被稱為細(xì)胞的“代謝感受器”或調(diào)控ATP和AMP水平的“燃料開關(guān)”。當(dāng)

3、AMP/ATP比值升高時(shí),AMPK被激活,可增強(qiáng)肝臟、肌肉等組織對葡萄糖的攝取、脂肪的氧化作用及胰島素的敏感性,并減少葡萄糖、膽固醇和甘油三酯的合成。在正常肝組織中表達(dá)較多量的AMPK,當(dāng)肝組織受損時(shí),肝組織表達(dá)AMPK減少。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的限速酶,AMPK能磷酸化ACC的79位點(diǎn)蘇氨酸而使其失活,從而使脂肪酸活化,進(jìn)而進(jìn)入β-氧化過程。固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)是一類位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核被膜上的膜連接蛋白,是

4、參與脂肪合成基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)是膽固醇合成的限速酶,ACC、HMGR的基因?yàn)镾REBP的靶基因,且二者又為AMPK的重要下游靶分子,因此,SREBP可能與AMPK調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇代謝的作用有關(guān)。AMPK可通過降低ACC、SREBP等下游激酶的活性抑制脂肪合成、促進(jìn)脂肪氧化分解。本研究旨在應(yīng)用酒精灌胃建立大鼠ALD模型,用免疫組織化學(xué)染色觀察AMPK-α2、ACC、SREBP-1c的表達(dá),用

5、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法觀察AMPK、ACC、SREBP mRNA的表達(dá)情況,用Western Blotting觀察AMPK-α2蛋白的含量,探討AMPK在ALD發(fā)病過程的表達(dá)及意義,為有效防治ALD提供新的思路。
　　 方法:選用雄性健康清潔級Wister大鼠50只,體重200±20g,正常飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分出10只為正常對照組,其余動物采用逐漸增加酒精濃度(濃度30％-60％,乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方

6、法酒精灌胃,分別于4周、8周、12周和16周末隨機(jī)處死動物10只、9只、8只和8只,留取血清及肝組織標(biāo)本；檢測血清ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL等生化指標(biāo)；取部分肝組織立即冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色,觀察肝細(xì)胞脂變性情況；另取肝組織固定于4％中性福爾馬林溶液,石蠟包埋,行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝組織的普通病理改變,天狼紅染色觀察肝組織纖維化程度,過碘酸希夫染色(PAS)觀察肝組織胞漿糖原變化；并用行AMPK-α2、ACC及S

7、REBP-1c免疫組織化學(xué)染色,觀察肝組織AMPK-α2、ACC及SREBP-1c蛋白表達(dá)情況；余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱,用RT-PCR觀察大鼠肝組織AMPK、ACC及SREBP mRNA的表達(dá),用WesternBlotting觀察AMPK-α2蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1血清肝功能指標(biāo)的變化:隨著造模時(shí)間的延長,血清ALT和AST水平逐漸升高,CHE逐漸降低,與正常對照組比較P<0.05或P<0

8、.01。
　　 2血清血脂指標(biāo)的變化:隨著造模時(shí)間的延長,血清TG、TC、LDL、VLDL的水平逐漸升高,HDL水平逐漸降低,與正常對照組比較P<0.05或P<0.01。
　　 3肝組織病理學(xué)改變:4周大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞脂肪變性,隨著造模時(shí)間的延長,肝細(xì)胞脂肪變性逐漸加重,肝小葉內(nèi)壞死灶明顯增多和纖維組織增生,16周大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫小泡性脂肪變性,竇周纖維化,匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成。冰凍切

9、片蘇丹Ⅳ染色顯示正常對照組大鼠肝組織無脂肪變性,模型4周組大鼠肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)少量紅色脂滴,隨著造模時(shí)間延長,紅色脂滴逐漸增多,至16周表現(xiàn)為大量紅色脂滴分布于肝細(xì)胞內(nèi)。PAS染色顯示正常組大鼠肝細(xì)胞胞漿中大量紫紅色顆粒分布,模型16周僅見機(jī)少量紫紅色顆粒。天狼紅染色顯示模型4周組大鼠肝組織無明顯纖維組織增生,模型12周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯竇周纖維化和纖維化間隔形成趨勢,模型16周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯纖維間隔。
　　 4免疫組化

10、法檢測大鼠肝組織AMPK-α2、ACC及SREBP-1c蛋白的表達(dá):光鏡下,正常組大鼠肝臟內(nèi)表達(dá)較多的AMPK-α2蛋白,隨著造模時(shí)間的延長陽性表達(dá)逐漸減少,主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)；正常組大鼠肝臟表達(dá)ACC較少,隨著造模時(shí)間的延長,ACC表達(dá)逐漸增加,主要表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)；正常組大鼠肝臟表達(dá)SREBP-1c較少,隨著造模時(shí)間的延長,SREBP-1c表達(dá)逐漸增加,主要表達(dá)于細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)。
　　 5 RT-PCR法檢測AMPK、A

11、CC及SREBPmRNA的表達(dá)量:正常組大鼠肝組織中表達(dá)較多的AMPK mRNA,隨著造模時(shí)間的延長,表達(dá)量逐漸減少,與正常對照組比較P<0.05；正常組大鼠肝組織中表達(dá)ACCmRNA較少,隨著造模時(shí)間的延長,其表達(dá)量逐漸增加,與正常對照組比較P<0.05；正常組大鼠肝組織中表達(dá)SREBPmRNA較少,隨著造模時(shí)間的延長,其表達(dá)量逐漸增加,與正常對照組比較P<0.05。
　　 6 Western Blotting法檢測大鼠肝組織

12、AMPK-α2蛋白的表達(dá):正常組大鼠肝臟內(nèi)表達(dá)較多的AMPK蛋白,隨著造模時(shí)間的延長,AMPK蛋白表達(dá)逐漸減少,與正常對照組比較P<0.05。
　　 7肝組織中AMPK-α2的相對表達(dá)量與血清ALT—T、AST水平呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.702和-0.487,P值分別為P<0.01和P<0.01,與CHE呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.606,P<0.01。
　　 8肝組織中AMPK-α2的相對表達(dá)量與血清TG、TC、LD

13、L、VLDL的水平呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.501、-0.619、-0.586和-0.388,P值分別為P<0.01、P<0.01、P<0.01和P<0.05,與HDL呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.563,P<0.01。
　　 9肝組織中AMPK-α2的相對表達(dá)量與ACC、SREBP-1c的表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.911和-0.907,P值分別為P<0.01和P<0.01。
　　 結(jié)論:
　　 1應(yīng)用

14、逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制備大鼠ALD模型,該模型肝臟病變?nèi)缰咀冃浴⒀装Y反應(yīng)和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變。
　　 2 ALD發(fā)病過程中存在脂質(zhì)代謝障礙紊亂,脂肪堆積于肝臟中。
　　 3 ALD發(fā)病過程中AMPK表達(dá)減少,對下游靶分子ACC、SREBP活化的抑制作用減弱,導(dǎo)致脂質(zhì)合成增多,氧化分解減少,造成脂肪堆積,參與ALD發(fā)病機(jī)制的“第一次打擊”,是造成肝臟功能損傷的重要因素之一。