腺苷酸活化蛋白激酶在酒精性肝病中的表達及意義.pdf

1、目的:酒精性肝病(ALD)是長期大量飲酒所致的肝臟損害性病變,其病理改變包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化。關于ALD的發(fā)病機理目前尚不清楚,近年來有人提出以氧化應激和脂質過氧化為中心的“二次打擊”假說,“第一次打擊”使脂肪合成增加,脂類沉積在肝細胞,導致脂肪肝,“第二次打擊”涉及氧化應激和脂質過氧化。乙醇進入人體后,代謝為乙醛和乙酸,對肝臟有直接毒性作用,可降低肝臟的抗氧化能力,引起脂質過氧化,從而導致肝

2、臟損傷。乙醇氧化過程中,還原型輔酶Ⅰ(NADH)產生增加,抑制三羧酸循環(huán),使肝內脂肪代謝障礙,導致脂肪堆積于肝臟中。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)存在于線粒體內,屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員,由α、β、γ三個亞基構成,α為催化亞基,β和γ為調節(jié)亞基。AMPK各亞基的組織分布不同,α1分布很廣,α2主要分布在肝臟、骨骼肌和心臟。AMPK的活性受AMP/ATP比值的調控,被稱為細胞的“代謝感受器”或調控ATP和AMP水平的“燃料開關”。當

3、AMP/ATP比值升高時,AMPK被激活,可增強肝臟、肌肉等組織對葡萄糖的攝取、脂肪的氧化作用及胰島素的敏感性,并減少葡萄糖、膽固醇和甘油三酯的合成。在正常肝組織中表達較多量的AMPK,當肝組織受損時,肝組織表達AMPK減少。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的限速酶,AMPK能磷酸化ACC的79位點蘇氨酸而使其失活,從而使脂肪酸活化,進而進入β-氧化過程。固醇調控元件結合蛋白(SREBP)是一類位于內質網(wǎng)和核被膜上的膜連接蛋白,是

4、參與脂肪合成基因的主要轉錄調節(jié)因子。羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)是膽固醇合成的限速酶,ACC、HMGR的基因為SREBP的靶基因,且二者又為AMPK的重要下游靶分子,因此,SREBP可能與AMPK調節(jié)脂肪酸和膽固醇代謝的作用有關。AMPK可通過降低ACC、SREBP等下游激酶的活性抑制脂肪合成、促進脂肪氧化分解。本研究旨在應用酒精灌胃建立大鼠ALD模型,用免疫組織化學染色觀察AMPK-α2、ACC、SREBP-1c的表達,用

5、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法觀察AMPK、ACC、SREBP mRNA的表達情況,用Western Blotting觀察AMPK-α2蛋白的含量,探討AMPK在ALD發(fā)病過程的表達及意義,為有效防治ALD提供新的思路。
　　 方法:選用雄性健康清潔級Wister大鼠50只,體重200±20g,正常飼養(yǎng)1周后隨機分出10只為正常對照組,其余動物采用逐漸增加酒精濃度(濃度30％-60％,乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方

6、法酒精灌胃,分別于4周、8周、12周和16周末隨機處死動物10只、9只、8只和8只,留取血清及肝組織標本；檢測血清ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL等生化指標；取部分肝組織立即冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色,觀察肝細胞脂變性情況；另取肝組織固定于4％中性福爾馬林溶液,石蠟包埋,行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝組織的普通病理改變,天狼紅染色觀察肝組織纖維化程度,過碘酸希夫染色(PAS)觀察肝組織胞漿糖原變化；并用行AMPK-α2、ACC及S

7、REBP-1c免疫組織化學染色,觀察肝組織AMPK-α2、ACC及SREBP-1c蛋白表達情況；余肝組織經液氮速凍后置于-80℃冰箱,用RT-PCR觀察大鼠肝組織AMPK、ACC及SREBP mRNA的表達,用WesternBlotting觀察AMPK-α2蛋白的表達情況。
　　 結果:
　　 1血清肝功能指標的變化:隨著造模時間的延長,血清ALT和AST水平逐漸升高,CHE逐漸降低,與正常對照組比較P<0.05或P<0

8、.01。
　　 2血清血脂指標的變化:隨著造模時間的延長,血清TG、TC、LDL、VLDL的水平逐漸升高,HDL水平逐漸降低,與正常對照組比較P<0.05或P<0.01。
　　 3肝組織病理學改變:4周大鼠肝細胞出現(xiàn)小葉中央靜脈周圍肝細胞脂肪變性,隨著造模時間的延長,肝細胞脂肪變性逐漸加重,肝小葉內壞死灶明顯增多和纖維組織增生,16周大鼠肝細胞呈現(xiàn)彌漫小泡性脂肪變性,竇周纖維化,匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成。冰凍切

9、片蘇丹Ⅳ染色顯示正常對照組大鼠肝組織無脂肪變性,模型4周組大鼠肝細胞胞漿中出現(xiàn)少量紅色脂滴,隨著造模時間延長,紅色脂滴逐漸增多,至16周表現(xiàn)為大量紅色脂滴分布于肝細胞內。PAS染色顯示正常組大鼠肝細胞胞漿中大量紫紅色顆粒分布,模型16周僅見機少量紫紅色顆粒。天狼紅染色顯示模型4周組大鼠肝組織無明顯纖維組織增生,模型12周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯竇周纖維化和纖維化間隔形成趨勢,模型16周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯纖維間隔。
　　 4免疫組化

10、法檢測大鼠肝組織AMPK-α2、ACC及SREBP-1c蛋白的表達:光鏡下,正常組大鼠肝臟內表達較多的AMPK-α2蛋白,隨著造模時間的延長陽性表達逐漸減少,主要表達于肝細胞胞漿內；正常組大鼠肝臟表達ACC較少,隨著造模時間的延長,ACC表達逐漸增加,主要表達于細胞漿內；正常組大鼠肝臟表達SREBP-1c較少,隨著造模時間的延長,SREBP-1c表達逐漸增加,主要表達于細胞漿或細胞核內。
　　 5 RT-PCR法檢測AMPK、A

11、CC及SREBPmRNA的表達量:正常組大鼠肝組織中表達較多的AMPK mRNA,隨著造模時間的延長,表達量逐漸減少,與正常對照組比較P<0.05；正常組大鼠肝組織中表達ACCmRNA較少,隨著造模時間的延長,其表達量逐漸增加,與正常對照組比較P<0.05；正常組大鼠肝組織中表達SREBPmRNA較少,隨著造模時間的延長,其表達量逐漸增加,與正常對照組比較P<0.05。
　　 6 Western Blotting法檢測大鼠肝組織

12、AMPK-α2蛋白的表達:正常組大鼠肝臟內表達較多的AMPK蛋白,隨著造模時間的延長,AMPK蛋白表達逐漸減少,與正常對照組比較P<0.05。
　　 7肝組織中AMPK-α2的相對表達量與血清ALT—T、AST水平呈負相關,相關系數(shù)分別為-0.702和-0.487,P值分別為P<0.01和P<0.01,與CHE呈正相關,相關系數(shù)為0.606,P<0.01。
　　 8肝組織中AMPK-α2的相對表達量與血清TG、TC、LD

13、L、VLDL的水平呈負相關,相關系數(shù)分別為-0.501、-0.619、-0.586和-0.388,P值分別為P<0.01、P<0.01、P<0.01和P<0.05,與HDL呈正相關,相關系數(shù)為0.563,P<0.01。
　　 9肝組織中AMPK-α2的相對表達量與ACC、SREBP-1c的表達量均呈負相關,相關系數(shù)分別為-0.911和-0.907,P值分別為P<0.01和P<0.01。
　　 結論:
　　 1應用

14、逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制備大鼠ALD模型,該模型肝臟病變如脂肪變性、炎癥反應和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變。
　　 2 ALD發(fā)病過程中存在脂質代謝障礙紊亂,脂肪堆積于肝臟中。
　　 3 ALD發(fā)病過程中AMPK表達減少,對下游靶分子ACC、SREBP活化的抑制作用減弱,導致脂質合成增多,氧化分解減少,造成脂肪堆積,參與ALD發(fā)病機制的“第一次打擊”,是造成肝臟功能損傷的重要因素之一。