獸疫鏈球菌基因敲除系統(tǒng)的建立及hasE功能研究.pdf

1、獸疫鏈球菌是工業(yè)上生產(chǎn)透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)的主要菌株。目前，工業(yè)上應(yīng)用的主要是通過誘變獲得的高產(chǎn)菌株，但缺乏遺傳穩(wěn)定性。幾株獸疫鏈球菌全基因組測(cè)序的完成，為獸疫鏈球菌基因功能研究提供了理論基礎(chǔ)。但是，目前還沒有高效的基因敲除系統(tǒng)的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以Streptococcus equi subsp.zooepidemicusATCC39920為研究對(duì)象，首先構(gòu)建基因無縫敲除系統(tǒng)，并通過透明質(zhì)酸合成酶基因（has

2、A）的敲除驗(yàn)證該系統(tǒng)的可行性，其次我們研究了葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因(hasE)的功能，主要研究結(jié)果如下:
　　在溫敏型自殺質(zhì)粒pSET4s上插入sacB（編碼蔗糖果聚糖酶）表達(dá)元件，以sacB作為反向篩選標(biāo)記構(gòu)建基因無縫敲除系統(tǒng)。研究結(jié)果顯示，sacB基因的表達(dá)使S.zooepidemicus在含有5％蔗糖的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，因此sacB可以作為獸疫鏈球菌基因敲除的反向篩選標(biāo)記。
　　利用上述系統(tǒng)對(duì)透明質(zhì)酸合成酶基因（h

3、asA）進(jìn)行敲除，驗(yàn)證該系統(tǒng)的可行性。結(jié)果顯示:(1)通過該系統(tǒng)成功獲得hasA基因敲除菌株△hasA。(2) hasA基因的敲除對(duì)has operon中其他基因不存在極性效應(yīng)。(3)△hasA菌株不產(chǎn)莢膜，通過基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)△hasA菌株又恢復(fù)產(chǎn)HA的能力。表明，△hasA菌株的缺陷僅是hasA基因缺失所致，與其他基因無關(guān)。同時(shí)，本研究所建立的基于sacB基因的獸疫鏈球菌基因無縫敲除系統(tǒng)可以用于基因功能研究。
　　hasE基因

4、編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(HASE，EC5.3.1.9)，催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之間的可逆反應(yīng)。為了研究hasE的基因功能，我們首先利用無縫敲除系統(tǒng)成功敲除hasE基因。表型分析顯示，在THY培養(yǎng)基上，△hasE菌株生長(zhǎng)緩慢，菌落較小，無明顯HA莢膜。分析△hasE菌株在不同碳源上的生長(zhǎng)情況顯示，△hasE菌株在以果糖為碳源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于其他碳源。表明，△hasE菌株可以利用果糖部分回補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)缺陷。通過