馬鏈球菌獸疫亞種間接ELISA診斷方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、根據(jù)GenBank上已經(jīng)公布的馬鏈球菌獸疫亞種重要保護(hù)性抗原類M蛋白(M-likeprotein)的編碼基因Szp的基因序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)引物。以馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246菌株的全基因組DNA為模板，通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出目的基因并定向克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，通過PCR鑒定和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定之后，確認(rèn)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，對(duì)陽性菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，并用異丙基-β-D-

2、硫代吡喃半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)其在低溫下進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，表明類M蛋白獲得了良好的表達(dá)，且以可溶性蛋白形式存在于上清中，蛋白分子量與推導(dǎo)值一致。Western-blot免疫印跡反應(yīng)顯示，所得目的蛋白可被豬源ATCC35246株康復(fù)血清識(shí)別，表明其具有良好的免疫原性。
　　 隨后用親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析純化蛋白后，通過Bradford蛋白定量法繪制了測(cè)定蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)，建立了回歸

3、方程，對(duì)獲得的類M蛋白進(jìn)行定量分析，測(cè)定了較為精確的類M蛋白的濃度。在此基礎(chǔ)上，用類M蛋白作為包被抗原，采用方陣滴定法，確定了抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度，并通過一系列的優(yōu)化試驗(yàn)，確定了最佳反應(yīng)試劑和操作規(guī)程，并組建了間接ELISA反應(yīng)試劑盒，隨后通過敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和保存期試驗(yàn)等對(duì)該試劑盒的敏感性、特異性和長(zhǎng)期應(yīng)用與保存條件進(jìn)行了檢驗(yàn)，并通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的40份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行了測(cè)定，確定了平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，根據(jù)

4、經(jīng)驗(yàn)公式確定了陰陽性臨界值。從而為后續(xù)的流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的豬血清400份，實(shí)驗(yàn)室保存的血清主要來自河南、上海、山東、安徽地區(qū)，采集自南京地區(qū)部分豬場(chǎng)的80份血清、肉聯(lián)廠的豬血清100份，用已經(jīng)建立的ELISA操作規(guī)程對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè);對(duì)常用試驗(yàn)動(dòng)物小鼠、家兔在試驗(yàn)前采集其血清各50份進(jìn)行檢測(cè)，以確定南京和揚(yáng)州地區(qū)部分試驗(yàn)動(dòng)物感染馬鏈球菌獸疫亞種的情況;對(duì)南京地區(qū)部分養(yǎng)牛場(chǎng)的血清50份進(jìn)行了檢測(cè)，以