砷損害學習記憶能力與NMDA受體功能變化的關系研究.pdf

1、前言及目的： 砷(Arsenic，As)是一種類金屬，在自然界廣泛分布于巖石、土壤和水環(huán)境中。世界上大約有20多個國家發(fā)現有地砷病病區(qū)或高砷區(qū)存在，飲用含砷超過0.0.mg/L水的人口在5000萬人以上，慢性砷中毒患者達數十萬。孟加拉、印度和中國是全世界病情最重、病區(qū)面積最大、受危害人口最多的國家。在我國目前暴露于飲用水砷濃度等于或超過0.0.mg/L的人口為560萬，暴露在飲用水砷濃度等于或超過0.0.mg/L的人口為1466

2、萬，這還不包括由于燃煤引起的燃煤型地方性砷中毒。 砷對健康的危害是多方面的，可引發(fā)多器官的組織學和功能上的異常改變，嚴重者還可導致癌癥，臨床上以末梢神經炎、皮膚色素代謝異常、掌跖部皮膚角化、肢端缺血壞疽、皮膚癌變?yōu)橹饕憩F。兒童每單位體重的日平均砷攝入量要高于人一生的日平均攝入量(特別是當砷來源于土壤時，因為兒童有近地游戲及愛吮吸手的習慣)，而且由于兒童處于生理發(fā)育階段對化學物質的毒作用更為敏感。流行病學調查顯示，砷中毒對青少年

3、的中樞神經系統(tǒng)損害主要表現為對學習記憶能力的損害。動物實驗結果與流行病學調查一致。目前，砷致學習記憶能力損害的分子機理尚不十分清楚。 海馬是腦邊緣系統(tǒng)中最重要的結構之一，是學習記憶等高級神經活動的重要部位。長時程增強(long-term potentiation，IXP)現被認為是海馬學習記憶的細胞突觸模式，在細胞水平檢測學習記憶能力的最經典的指標。N-甲基-D-天門冬氨酸受體是興奮型氨基酸特異性受體的一種、具有許多不同變構調控

4、位點并對Ca2+高度通透的配體門控性離子通道，是由NR1、NR2(A-D)和NR3(A-B)亞單位組成的異聚體，近年來被認為是學習記憶中的關鍵物質而受到人們的關注。NMDA受體的亞基組成、受體胞內信號轉導通路在LTP的誘導和維持中起重要作用。文獻報道，急、慢性砷暴露可以抑制大鼠海馬LTP的誘導和維持。因此，我們推測砷可能通過影響NMDA受體各亞基的表達水平及胞內信號傳導通路，從而損害青少年的學習記憶能力。 本研究以幼鼠為模型，通

5、過飲水砷染毒，觀察砷暴露對大鼠學習記憶能力、對NMDA受體各亞基的表達水平及胞內信號傳導通路的影響，以探討砷致學習記憶損害的分子機制，為防治砷中毒提供理論依據。 方法： 1.選用斷乳健康SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠180只，體重40-50 g，在標準SPF級動物房內飼養(yǎng)。對照組大鼠飲用滅菌自來水，實驗組大鼠分別飲用2.72 mg/L、13.6 mg/L和68 mg/L亞砷酸鈉水溶液。飲水每兩天更換一次。染

6、毒時間分別為：1個月、2個月和3個月。用Morris水迷宮對大鼠進行行為學檢測。實驗終期，大鼠經10％水合氯醛腹腔麻醉，心臟采血后，斷頭分離腦組織，將腦組織在冰冷生理鹽水中漂洗，用濾紙吸干，置于-70℃冰箱保存。 2.采用微波消解-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HG-AFS)測定血砷、腦砷含量。分別取全血0.5 mL、腦組織0.2 g于聚四氟乙烯管，經微波消解儀消化。測量前，每個樣品加5 ml5％硫脲+5％抗壞血酸，然后用5％鹽酸

7、定容，混勻，用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定血砷和腦砷含量。砷的測定采用砷標準溶液進行質量控制。 3.用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學習記憶能力改變，測試包括定位航行實驗、空間探索實驗和可視平臺實驗三個部分。 4.大鼠經腹腔麻醉后，斷頭，在冰上快速分離海馬，用雙面刀片切取1 mm3海馬CA1區(qū)組織塊，2.5％的戊二醛溶液4℃固定24 h。漂洗，1％鋨酸后固定，丙酮脫水，飽和醋酸鈾電子染色，環(huán)氧樹脂-618包埋。半薄切

8、片(片厚1μm)，。TECNAI-10電子顯微鏡觀察，照相。 5.收集暴露3個月的大鼠海馬，采用RT-PCR、Western-blot和免疫組化法檢測海馬中NMDA受體NR1、NR2A、NR2B亞基基因和蛋白表達。 6.檢測飲水砷暴露對大鼠海馬NMDA受體信號傳導通路的影響。用SignaTECT蛋白激酶檢測試劑盒測定CaMKII活性，用Western-blot檢測CaMKIIα的蛋白表達及磷酸化狀態(tài)；用Western-b

9、lot檢測PSD-95、SynGAP、ERK1/2蛋白表達。 結果： 1.實驗期間，實驗組和對照組大鼠外觀和一般情況良好，沒有出現中毒癥狀。從第六周開始，68 mg/L劑量組大鼠體重增幅減慢，與對照組和其它兩個實驗組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這種差異一直維持到實驗結束。 2.在三個時間點，各實驗組大鼠血砷、腦砷值均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明，砷在大鼠血液和腦組織中有不

10、同程度的蓄積，我們成功的建立了砷中毒大鼠模型。 3.染毒1個月和2個月的大鼠，空間學習記憶能力受損不明顯；染毒3個月，砷暴露組大鼠逃逸潛伏期延長(P<0.05)，而空間探索實驗和可視平臺實驗數據差異均沒有統(tǒng)計學意義。說明砷暴露組大鼠已經出現了學習記憶損害。 4.透射電鏡觀察發(fā)現，砷暴露組能見到較多變性神經元，胞體皺縮變小，形態(tài)不規(guī)則；胞漿濃縮，基質染色變深；細胞器腫脹、空化，線粒體腫脹，脊減少或無脊，粗面內質網RER擴張

11、。毛細血管周圍結構明顯水腫，血管管腔不規(guī)則，內皮細胞中部分粗面內質網、高爾基復合體、線粒體可見明顯的擴張。突觸前成分中突觸小泡數量較少，軸突空化，軸突質淡。 5.飲水砷暴露后，大鼠海馬NMDA受體NR2A亞基的mRNA和蛋白表達都受到抑制，與對照相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而NR1和NR2B亞基的mRNA和蛋白表達沒有受到明顯影響。 6.砷暴露后，大鼠海馬CaMKII活性受到明顯抑制，與對照相比具有統(tǒng)計學意義(P

12、<0.05)；CaMKIIα的蛋白表達及磷酸化狀態(tài)沒有改變。砷暴露后，PSD-95、ERK1/2蛋白表達下降(P<0.05)，而SynGAP蛋白表達增高(P<0.05)。 結論： 1.飲水砷暴露后，砷能進入血液循環(huán)，透過血腦屏障在腦組織內蓄積，引起腦組織超微結構改變，損害大鼠的空間學習記憶能力。 2.砷暴露抑制NMDA受體NR2A亞基的表達，對NR1和NR2B亞基表達沒有明顯影響。NMDA受體亞基表達的改變，會影