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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:腎癌又稱(chēng)腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是臨床最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一,占到了所有成人惡性腫瘤的2-3%。在西方國(guó)家其發(fā)病率較高,在歐洲每年一般較上一年有2%的增幅,這與一些能夠發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀RCC的先進(jìn)檢查技術(shù)的應(yīng)用及人們對(duì)RCC認(rèn)識(shí)的加深有著一定的關(guān)系。盡管在一些北歐國(guó)家如瑞典和丹麥,RCC發(fā)病率維持穩(wěn)定甚至有小幅的下降,但是在其他的歐洲國(guó)家,其發(fā)病率仍呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。在我國(guó)泌尿外科惡性腫瘤發(fā)病率
2、中,RCC僅次于膀胱癌,占第二位。60到70歲之間是RCC的發(fā)病高發(fā)年齡段,其男女患者性別比為3∶2。其發(fā)病原因與吸煙,高血壓、高血脂都有一定程度的關(guān)系。因?yàn)槟I在體內(nèi)位置比較隱蔽,加之臨床癥狀多變,RCC難以早期發(fā)現(xiàn),約有半數(shù)的腎癌是偶然發(fā)現(xiàn)的。典型的腎癌三聯(lián)征(腰痛、肉眼血尿及腰腹部包塊)僅見(jiàn)于約6-10%的RCC患者。RCC確診時(shí)約35%的患者已有淋巴轉(zhuǎn)移,而一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,即使行腎癌根治術(shù),患者生存期也極少超過(guò)5年,RCC患者若出現(xiàn)
3、肝肺骨等遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移則預(yù)后更差。RCC對(duì)放、化療均不敏感,因此RCC的常規(guī)輔助治療不包括放、化療等治療。新的治療手段如基因靶向治療等雖有望成為治愈RCC的有效治療方法之一,但是目前最突出的問(wèn)題是缺乏理想而可靠的治療標(biāo)靶。因此尋找調(diào)控RCC基因治療的分子標(biāo)靶,明確其在RCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制,已逐漸成為目前研究工作的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
EZH2(enhancer ofzeste homolog2)基因與果蠅zeste基因增強(qiáng)子(
4、E(z))是同源基因,是聚硫蛋白復(fù)合物基因家族(polycomb group,PcG)中的一員,是一種進(jìn)化上高度保守的基因。PcG家族和與其有著拮抗作用的Trithorax group(TrxG)基因家族都是在進(jìn)化過(guò)程中保守的染色質(zhì)修飾基因,他們共同調(diào)控同源異形基因(homeotic gene)的沉默和活化,其中同源異形基因的激活由TrxG蛋白決定,而PcG蛋白則維持基因的失活狀態(tài)。1996年,EZH2基因最早由Chen等人研究Down
5、氏綜合癥致病基因位點(diǎn)的毗鄰基因時(shí)發(fā)現(xiàn)。有研究表明EZH2可抑制正常細(xì)胞中的抑癌基因的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖,并且能夠刺激腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散。近年來(lái)越來(lái)越多的研究證實(shí)人EZH2蛋白和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能有相關(guān)性,通過(guò)后者參與了DNA甲基化;還有部分學(xué)者認(rèn)為由于EZH2可抑制抑癌基因的表達(dá),因此其可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中基因表達(dá)的異常。由此可推斷EZH2可能成為一種新的腫瘤標(biāo)志物。
RNA干擾(RNAi)最先由Fire等在19
6、98年提出,具有特異性強(qiáng)、作用效率高、干擾作用可擴(kuò)散及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),對(duì)目的基因有著很強(qiáng)的抑制作用。轉(zhuǎn)錄后抑制是RNAi的主要機(jī)制,其作用過(guò)程可基本上分為啟動(dòng)階段和效應(yīng)階段,所使用的轉(zhuǎn)染表達(dá)載體包括質(zhì)粒、病毒和人造載體等?;蛲怙@子序列是RNAi的作用靶點(diǎn)位,尤其是保守序列其干擾效果最好;而其對(duì)基因的啟動(dòng)子、內(nèi)含子和終止子等序列無(wú)干擾作用。通過(guò)RNAi對(duì)腎癌細(xì)胞EZH2基因的沉默,我們希望能夠找到以下問(wèn)題的答案:EZH2基因在RCC發(fā)生
7、發(fā)展中的作用如何?其與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的關(guān)系如何?其機(jī)制可能是什么?關(guān)于這系列問(wèn)題目前尚無(wú)系統(tǒng)研究與相應(yīng)報(bào)告。
基于此目的和背景,本研究擬進(jìn)行:
1.EZH2在人RCC組織及RCC細(xì)胞系A(chǔ)CHN中的表達(dá)及意義;
2.靶向EZH2的siRNA真核干預(yù)載體的構(gòu)建;
3.在RCC細(xì)胞株ACHN利用siRNA敲減EZH2,了解其對(duì)RCC細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲力的影響;
8、 4.探討干擾EZH2對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路表達(dá)的影響。
第一部分EZH2在人腎癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)水平的研究
目的:1.研究EZH2在RCC組織和“正常”腎臟組織中的表達(dá)情況及意義;2.研究EZH2基因mRNA及EZH2蛋白在人腎癌細(xì)胞株ACHN及成人正常腎近曲小管上皮細(xì)胞株HK-2中的表達(dá)情況,作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法:1.應(yīng)用S-P免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)66例RCC及8例對(duì)照標(biāo)本
9、為腎臟外傷后切除的腎臟(病理證實(shí)為正常腎臟組織)組織中的EZH2表達(dá),并結(jié)合標(biāo)本來(lái)源患者的臨床和病理資料進(jìn)行分析;2.采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-Ploymerase chainreaction,RT-PCR)檢測(cè)人腎癌細(xì)胞株ACHN及人正常腎近曲小管上皮細(xì)胞株HK-2中EZH2基因mRNA含量,免疫印記Western Blot分別檢測(cè)細(xì)胞株ACHN和HK-2中的EZH2蛋白含量。
10、 結(jié)果:1.66例RCC組織中EZH2蛋白的表達(dá)情況:陽(yáng)性48例,陰性18例,陽(yáng)性率為72.7%;8例“正?!蹦I臟組織中EZH2蛋白的表達(dá)情況:陽(yáng)性1例,陰性7例,陽(yáng)性率為12.5%,兩者比較RCC中EZH2蛋白陽(yáng)性率明顯高于“正?!蹦I臟組織,P=0.002。2.EZH2在RCC組織中的表達(dá)與腫瘤的臨床Robson分期、腫瘤直徑大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、腎癌的病理類(lèi)型相關(guān)(P<0.05);而與患者年齡、性別、病理Fuhrman分級(jí)無(wú)相關(guān)性(
11、P>0.05)。3.RT-PCR檢測(cè)EZH2條帶顯影定位于193bp處,內(nèi)參GAPDH條帶顯影定位于450bp處。根據(jù)所測(cè)得IOD比值計(jì)算(IODEZH2/IODGAPDH),ACHN細(xì)胞株EZH2基因mRNA含量(0.648±0.003)明顯高于HK-2細(xì)胞株(0.333±0.025),表達(dá)差異具有顯著性(P<0.01)。4.Western blot檢測(cè)EZH2條帶顯影定位于80KD處,內(nèi)參GAPDH條帶顯影定位于37KD處。根據(jù)所測(cè)
12、得IOD比值計(jì)算(IODEZH2/IODGAPDH),ACHN細(xì)胞株EZH2蛋白表達(dá)(0.290±0.009)明顯高于HK-2細(xì)胞株(0.136±0.012),表達(dá)差異具有顯著性(P<0.01)。
結(jié)論:1.EZH2在RCC組織中明顯高表達(dá),并且與腫瘤的臨床分期相關(guān),提示其與RCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),對(duì)于人RCC的早期診斷及預(yù)后判斷可能有重要的意義;2.人腎癌細(xì)胞株ACHN中EZH2基因mRNA含量和EZH2蛋白含量明顯
13、高于成人正常腎近曲小管上皮細(xì)胞系HK-2,ACHN細(xì)胞株可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。
第二部分靶向EZH2的siRNA有效序列的確定和干預(yù)載體的構(gòu)建
目的:構(gòu)建針對(duì)目的基因EZH2的siRNA干預(yù)載體,并證實(shí)該載體轉(zhuǎn)染人腎癌ACHN細(xì)胞后是否對(duì)EZH2基因表達(dá)有抑制作用。
方法:根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道選擇EZH2基因cDNA序列的461-481堿基為標(biāo)靶序列,設(shè)計(jì)目的shRNA所對(duì)應(yīng)的DNA模板鏈,退
14、火處理后克隆到含U6啟動(dòng)子的空質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo,并構(gòu)建重組質(zhì)粒:pGPU6/GFP/Neo-EZH2 shRNA,經(jīng)酶切測(cè)序證實(shí)后,脂質(zhì)體介導(dǎo)將pGPU6/GFP/Neo-EZH2 shRNA轉(zhuǎn)染人腎癌ACHN細(xì)胞株。再以Western Blot方法檢測(cè)EZH2蛋白表達(dá)是否下降以證實(shí)該載體的作用。
結(jié)果:將靶向EZH2基因RNAi的shRNA模板順利插入空質(zhì)粒載體,抽提并純化正確重組質(zhì)粒,根據(jù)所設(shè)立的三個(gè)
15、平行組:A組為空白組(ACHN細(xì)胞未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組)、B組為陰性對(duì)照組(ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo空質(zhì)粒組)和C組為干擾組(ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-EZH2 siRNA組)。以Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三組ACHN細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá),根據(jù)所測(cè)得IOD比值計(jì)算(IODEZH2/IODGAPDH),C組ACHN細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá)明顯低于A、B兩組ACHN細(xì)胞(P<0.01),A、B兩組ACHN細(xì)
16、胞EZH2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
結(jié)論:1.成功構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo-EZH2 shRNA穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒;2.成功構(gòu)建了EZH2 siRNA穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞;3.EZH2 siRNA顯著下調(diào)了人腎癌細(xì)胞株ACHN細(xì)胞EZH2蛋白的表達(dá)。
第三部分干擾EZH2基因?qū)θ四I癌細(xì)胞株ACHN增殖、凋亡及侵襲能力的影響
目的:使用特異性的EZH2-shRNA干擾序列轉(zhuǎn)染人腎癌細(xì)胞株A
17、CHN,誘導(dǎo)EZH2基因沉默,觀察其對(duì)ACHN細(xì)胞增殖活性、凋亡及侵襲能力的影響。
方法:使用第二部分中構(gòu)建的干預(yù)載體在最佳轉(zhuǎn)染條件下,用質(zhì)粒載體法轉(zhuǎn)染ACHN細(xì)胞株,根據(jù)所設(shè)立的三個(gè)平行組:A組為空白組(ACHN細(xì)胞未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組)、B組為陰性對(duì)照組(ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo空質(zhì)粒組)和C組為干擾組(ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-EZH2 siRNA組),應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)(Annex
18、in V/PI雙染法)及Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)三組中ACHN細(xì)胞株的細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力。
結(jié)果:1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組ACHN細(xì)胞凋亡指數(shù)AI值,根據(jù)所測(cè)得AI值(%)計(jì)算,C組ACHN細(xì)胞凋亡指數(shù)高于A、B兩組ACHN細(xì)胞凋亡指數(shù),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而A、B兩組ACHN細(xì)胞凋亡指數(shù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。2.分別于轉(zhuǎn)染24h、48h、72h及96h后,MTT比色法檢測(cè)三組ACH
19、N細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況,除24h點(diǎn)外(P>0.05),其余時(shí)間點(diǎn)(48h、72h及96h)MTT檢測(cè)C組ACHN細(xì)胞570nm波長(zhǎng)處OD值明顯低于A、B兩組ACHN細(xì)胞(P<0.01),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組ACHN細(xì)胞的侵襲能力,根據(jù)所測(cè)得下室中細(xì)胞數(shù)計(jì)算,C組ACHN細(xì)胞進(jìn)入下室內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯少于A、B兩組ACHN細(xì)胞,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而A、B兩組ACHN細(xì)胞進(jìn)入下室內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)
20、學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:1.EZH2 siRNA能夠明顯促進(jìn)ACHN細(xì)胞的凋亡;2.EZH2siRNA能夠明顯抑制ACHN細(xì)胞的增殖,并且這種抑制作用存在時(shí)間效應(yīng)關(guān)系;3.EZH2 siRNA能夠明顯抑制ACHN細(xì)胞的侵襲能力。
第四部分EZH2-siRNA抑制人腎癌細(xì)胞株ACHN的分子生物學(xué)機(jī)制及與WNT/β-catenin信號(hào)通路系統(tǒng)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究
目的:探討EZH2-siRNA抑制
21、人腎癌細(xì)胞株ACHN的分子生物學(xué)機(jī)制及與WNT/β-catenin信號(hào)通路系統(tǒng)的關(guān)系。
方法:同第三部分設(shè)立A組:空白組(未轉(zhuǎn)染組)、B組:對(duì)照組(陰性對(duì)照載體組)和C組:RNA干擾組(干擾載體組)三組。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)三組ACHN細(xì)胞WNT3α、β-catenin、GSK-3βmRNA的變化,Western Blot檢測(cè)三組ACHN細(xì)胞WNT3α、β-catenin、GSK-3β蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:1.
22、PCR檢測(cè)WNT3α條帶顯影定位于243bp處,β-catenin條帶顯影定位于194bp處,GSK-3β條帶顯影定位于153bp處,內(nèi)參GAPDH條帶顯影定位于450bp處。根據(jù)所測(cè)得WNT3α、β-catenin及GSK-3β的IOD值分別與各自同時(shí)進(jìn)行電泳的內(nèi)參GAPDH的IOD值計(jì)算IOD比值(IODWNT3α/IODGAPDH、IODβ-catenin/IODGAPDH、IODGSK-3β/IODGAPDH),C組ACHN細(xì)胞
23、GSK-3β基因mRNA含量明顯高于A、B兩組ACHN細(xì)胞,表達(dá)差異具有顯著性(P<0.01,P<0.05);而WNT3α、β-catenin基因mRNA在C組ACHN細(xì)胞中的含量明顯低于A組ACHN細(xì)胞(P<0.01,P<0.01)和B組ACHN細(xì)胞(P<0.01,P<0.05),表達(dá)差異具有顯著性。A、B兩組ACHN細(xì)胞WNT3α、β-catenin及GSK-3β三種基因mRNA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。2.Wester
24、n blot檢測(cè)WNT3α條帶顯影定位于43KD處,WNT3α條帶顯影定位于92KD處,WNT3α條帶顯影定位于47KD處,內(nèi)參GAPDH條帶顯影定位于37KD處。根據(jù)所測(cè)得WNT3α、β-catenin及GSK-3β的IOD值分別與所測(cè)內(nèi)參GAPDH的IOD值計(jì)算IOD比值(IODWNT3α/IODGAPDH、 IODβ-catenin/IODGAPDH、IODGSK-3β/IODGAPDH),C組ACHN細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)明顯
25、高于A、B兩組ACHN細(xì)胞,表達(dá)差異具有顯著性(P<0.01);而WNT3α、β-catenin蛋白在C組ACHN細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于A、B兩組ACHN細(xì)胞,表達(dá)差異具有顯著性(P<0.01)。
結(jié)論:1,EZH2 siRNA能夠明顯抑制腎癌ACHN細(xì)胞中WNT3α、β-catenin基因mRNA及蛋白的表達(dá);2.EZH2 siRNA能夠明顯促進(jìn)腎癌ACHN細(xì)胞中GSK-3β基因mRNA及蛋白的表達(dá);3.EZH2 siRN
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