EZH2 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達及其相關(guān)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma, NB)是兒童最常見的顱外實體瘤，目前國內(nèi)對早期、低危NB已取得較好的治療效果，但晚期NB，雖然結(jié)合運用了手術(shù)、大劑量化療、放療及自體干細(xì)胞移植等手段，患兒五年生存率仍維持在50％左右，單純地加大手術(shù)、放化療強度已經(jīng)很難有效提高患兒的治療效果，未來的治療方向應(yīng)該是更加特異性、敏感性的治療手段—分子靶向治療。因此，尋求新而有效的潛在NB分子靶點具有重要意義。EZH2(e

2、nhancer ofzeste homolog2,EZH2)蛋白是多梳抑制復(fù)合物2（polycomb repressor complex2, PRC2）的核心催化元件，通過促使組蛋白H3甲基化對靶基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。研究顯示，EZH2高表達是多種癌病預(yù)后不良的因素，在 NB中，同樣發(fā)現(xiàn) EZH2在表觀遺傳上沉默NB抑癌基因CASZ1、CLU、RUNX3和NGFR，提示EZH2可做為NB分子靶向的潛位點。本課題的研究目的在于檢測EZH2

3、蛋白在NB組織水平中的表達情況，并結(jié)合臨床資料分析其表達水平與NB患兒臨床病理因素和生存預(yù)后的關(guān)系，然后在NB細(xì)胞系中穩(wěn)定過表達和降表達EZH2，進一步研究EZH2對NB發(fā)生發(fā)展的作用機制。
　　研究方法和主要結(jié)果：
　　1.EZH2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的蛋白表達情況
　　方法：利用免疫組化的方法檢測74例NB組織中EZH2的表達情況。
　　結(jié)果：74例患兒中陰性表達EZH22例，弱陽性表達EZH221例，陽性表

4、達EZH231例，強陽性表達EZH220例，即EZH2弱表達23例，強表達51例。
　　2.EZH2表達與NB患兒臨床病理特點及生存預(yù)后分析
　　方法：利用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析EZH2表達情況與NB患兒臨床病理因素之間和患兒生存預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果：經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，EZH2強表達與患兒腫瘤高分期（X2=6.931，P=0.008）、腫瘤伴有遠處轉(zhuǎn)移（X2=5.722，P=0.017）及Ki67強表達（X2=

5、29.827，P=0.000）正相關(guān)，與短期治療效果達VGPR以上呈一定的負(fù)相關(guān)，P值接近0.05（X2=4.045， P=0.052）。分析EZH2表達與患兒治療后復(fù)發(fā)情況提示，EZH2強表達與患兒復(fù)發(fā)存在一定的相關(guān)性，但P值大于0.05（X2=2.699，P=0.100）。而EZH2表達情況與患兒年齡、性別、原發(fā)部位及病理類型未見明顯相關(guān)性(P>0.05)。
　　3.構(gòu)建穩(wěn)定過表達和降表達EZH2的NB細(xì)胞系，并分析其對NB細(xì)

6、胞生物學(xué)行為的影響
　　方法：通過構(gòu)建過表達EZH2和小RNA干擾下調(diào)EZH2的慢病毒表達質(zhì)粒的方法，建立穩(wěn)定過表達和降表達EZH2的NB細(xì)胞系，并利用MTT、Edu增殖實驗和Transwell等方法研究EZH2對NB細(xì)胞的生長增殖和遷移的影響。
　　結(jié)果：（1）成功建立穩(wěn)定過表達EZH2的NB細(xì)胞系SK-N-BE(2)-EZH2-COPGFP和降表達EZH2的NB細(xì)胞系SK-N-BE(2)-shEZH2-74、SK-N-B

7、E(2)-shEZH2-77，并Western Blotting驗證；
　?。?）在SK-N-BE(2)細(xì)胞中穩(wěn)定過表達EZH2后，細(xì)胞增殖能力和遷移能力均較對照和空白組增強；
　?。?）在SK-N-BE(2)細(xì)胞中利用小RNA干擾下調(diào)EZH2表達后，細(xì)胞增殖能力和遷移能力均較對照和空白組明顯減弱。
　　4. EZH2在NB誘導(dǎo)分化中的作用影響
　　方法：利用反式維甲酸(RetinoicAcid, RA)和5-溴

8、脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromodeoxyuridine, Brdu)誘導(dǎo)NB細(xì)胞系分化后，研究EZH2對NB誘導(dǎo)分化的作用影響。
　　結(jié)果：（1）經(jīng) RA誘導(dǎo)刺激后，SK-N-BE(2)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的神經(jīng)分化，神經(jīng)軸突絲明顯，相互交錯，胞體變小，細(xì)胞胞體之間聚集，囊泡分泌增多，呈神經(jīng)節(jié)樣生長，細(xì)胞生長速度明顯變慢；
　　（2）經(jīng) Brdu誘導(dǎo)刺激后，SK-N-BE(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)未發(fā)生明顯變化，但扁平寬大細(xì)胞（類似基質(zhì)細(xì)胞）

9、成份略增多，細(xì)胞生長速度未見明顯差異；
　　（3）經(jīng)RA刺激后，EZH2、CD133和Vimentin蛋白均明顯減少，而Brdu誘導(dǎo)后EZH2和Vimentin蛋白表達增多，而CD133蛋白變化不明顯。
　　結(jié)論：
　　1.EZH2在高分期、伴有遠處轉(zhuǎn)移的NB患兒組織中高表達，與Ki-67表達成顯著正相關(guān)性，并與患兒預(yù)后負(fù)相關(guān)，提示EZH2是NB的一個促癌因素；
　　2.細(xì)胞功能實驗顯示，EZH2促進SK-N-B