Snf5和Ezh2調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探討染色體重塑復(fù)合物SWI/SNF核心亞基Snf5和組蛋白甲基化酶Ezh2調(diào)控自噬發(fā)生的作用和作用機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分：取基因型均為Snf5flox/flox的雄鼠和雌鼠合籠交配，通過(guò)陰道栓確認(rèn)懷孕，13天后解剖懷孕母鼠取出胚胎，制備基因型為Snf5flox/flox的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代，并凍存細(xì)胞。將腺病毒表達(dá)質(zhì)粒 YFP-Cre和包膜質(zhì)粒10A1共轉(zhuǎn)染入人腎上皮細(xì)胞系29

2、3t細(xì)胞，包裝出腺病毒，使用病毒液感染制備好的基因型為Snf5flox/flox的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。流式篩選出Snf5-/-細(xì)胞，利用EBSS培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中自噬標(biāo)記LC3-I、LC3-II表達(dá)量變化，檢測(cè)自噬水平變化。
　　第二部分：利用已有的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中敲除Snf5基因后的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因集富集分析。選取Snf5缺失的BT12、G401惡性橫紋肌樣瘤MRT（

3、malignant rhabdoid tumor）細(xì)胞系,以Hela子宮頸癌細(xì)胞系作為對(duì)照，分別使用EBSS培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行梯度時(shí)間饑餓處理，Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中LC3-I、LC3-II表達(dá)量變化，檢測(cè)自噬水平變化。使用Ezh2小分子抑制劑EPZ6438，分別以一定的濃度梯度處理Snf5缺失的A204、G401細(xì)胞，Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H3K27me3水平和LC3-I、LC3-II表達(dá)量變化，檢測(cè)自噬水平變

4、化。
　　結(jié)果：
　　第一部分：利用 Cre-loxP系統(tǒng)，將包裝好的表達(dá) Cre酶的腺病毒感染Snf5flox/flox小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)篩選出Snf5-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，使用EBSS進(jìn)行梯度時(shí)間饑餓處理后，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Snf5-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在饑餓處理0h時(shí)LC3-II水平就明顯升高，提示在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中敲除Snf5可能誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬的發(fā)生。
　　第二部分：基

5、因富集分析的結(jié)果顯示，在敲除了Snf5小鼠胚胎成纖維細(xì)胞基因表達(dá)變化的排序中，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因RB下游相關(guān)基因的基因集在頂端發(fā)生明顯富集，而轉(zhuǎn)錄因子E2F的靶基因與自噬調(diào)控相關(guān)，揭示可能Snf5缺失引起的RB/E2F信號(hào)通路異常影響了自噬。使用EBSS培養(yǎng)液對(duì)Hela、BT12、G401細(xì)胞系進(jìn)行梯度時(shí)間饑餓處理，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞中LC3-II的水平無(wú)明顯變化，而Snf5缺失的BT12、G401細(xì)胞中

6、LC3-II水平在饑餓1h時(shí)就明顯升高，揭示誘導(dǎo)自噬發(fā)生。EPZ6438是一種Ezh2小分子抑制劑，能夠通過(guò)抑制Ezh2活性而降低H3K27me3的水平。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用EPZ6438處理A204、G401惡性橫紋肌樣瘤細(xì)胞系時(shí)，均在抑制劑濃度為10μM，處理96h后，H3K27me3水平明顯降低，同時(shí)LC3-II的水平明顯升高，揭示誘導(dǎo)自噬發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　1、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的自噬可能是

7、受Snf5調(diào)控的。敲除Snf5基因后，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞自噬水平明顯升高。
　　2、在敲除了Snf5小鼠胚胎成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜變化排序中，并未發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因集在其頂部或底部富集，而結(jié)果顯示，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因RB下游相關(guān)基因的基因集在其頂部明顯富集，揭示可能Snf5缺失引起的RB/E2F信號(hào)通路異常影響了自噬。
　　3、饑餓誘導(dǎo)自噬，相較于子宮頸癌Hela細(xì)胞系，Snf5缺失的惡性橫紋肌樣瘤A204、G401細(xì)胞系具有較