再生心肌細(xì)胞的另一新來源——人胎盤組織.pdf

1、目的： 心血管疾病是影響人類健康的主要疾患之一，在臨床上其發(fā)病率與死亡率較高。各種病因?qū)е滦募〖?xì)胞凋亡、壞死，造成心肌細(xì)胞大量丟失，受損的心肌被瘢痕組織所替代，最終導(dǎo)致心功能衰竭，甚至死亡。其中以心肌梗死、冠心病最為常見。對于缺血性心臟病，傳統(tǒng)的治療方式是通過藥物、介入、溶栓等方法恢復(fù)缺血區(qū)的血流量，但并不能阻止心肌不可逆性損傷的進(jìn)程[1]。心臟移植可以治療嚴(yán)重的心功能衰竭，但這一有效的治療措施受供體來源和免疫排斥反應(yīng)等的限制。

2、盡管研究發(fā)現(xiàn)，心肌中存在具有再生能力的心肌前體細(xì)胞(cardiac progenitor cells，CPCs)在心梗后可發(fā)生分裂增殖，但CPCs數(shù)量有限，只能修復(fù)毛細(xì)血管閉塞后的亞臨床病變，而不能完整地修復(fù)組織，不足以阻止心室重構(gòu)、心功能衰竭的發(fā)生。隨著人類對干細(xì)胞認(rèn)識的加深，利用干細(xì)胞分化潛能再生心肌細(xì)胞，修復(fù)受損的心肌組織，恢復(fù)心臟功能，已經(jīng)成為目前治療心功能衰竭的一種新的策略，這種可用于移植的干細(xì)胞稱為種子細(xì)胞。 目前多

3、數(shù)干細(xì)胞治療心臟病僅處于細(xì)胞培養(yǎng)與動物模型方面，在臨床嘗試中多采用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和外周血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，回避了應(yīng)用胚胎干細(xì)胞的倫理與法律問題，同時自體成體干細(xì)胞移植也回避了免疫排斥反應(yīng)問題。但是，間充質(zhì)干細(xì)胞在成人骨髓內(nèi)含量極低，僅占有核細(xì)胞數(shù)的0.01-0.1％，并且心血管疾病多好發(fā)于中老年人

4、，因骨髓組織隨年齡增長紅骨髓減少，黃骨髓增多，因此患者骨髓內(nèi)干細(xì)胞數(shù)量與質(zhì)量大多降低，患者得不到足夠數(shù)量的干細(xì)胞，所以尋找新的干細(xì)胞來源及提高其臨床應(yīng)用效果成為研究熱點。 早在2000年即有學(xué)者從凍存的胎盤組織中分離培養(yǎng)出貼壁細(xì)胞，近年來，越來越多的實驗證實胎盤中存在大量干細(xì)胞，并且這種胎盤來源的干細(xì)胞具有多向分化潛能，已證實可以向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肌細(xì)胞方向分化[6～8]，但對心肌細(xì)胞方向分化的研究報道甚

5、少。本研究從人胎盤中分離干細(xì)胞，并誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞分化，探討其作為種子細(xì)胞治療心肌梗死的可能性，為臨床冠心病的治療提供一條新思路。 方法： 1、胎盤細(xì)胞提?。喝∽阍缕蕦m產(chǎn)新生兒的胎盤(來源于沈陽菁華醫(yī)院婦產(chǎn)科健康足月剖宮產(chǎn)新生兒胎盤組織)，剝離子體面蛻膜，剪取蛻膜下組織，PBS(含100U/ml青鏈霉素)沖洗兩次，室溫靜置10min，將組織塊剪碎約1mm3，均勻置于培養(yǎng)皿底部，應(yīng)用10％DMEM培養(yǎng)基(含10％FBS、0

6、.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青鏈霉素、0.1mmol/L β-巰基乙醇)培養(yǎng)于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱，每3d換液1次，待細(xì)胞沿培養(yǎng)皿底部生長面積達(dá)80％-90％時，按常規(guī)方法傳代，傳代3次后用于檢測及誘導(dǎo)分化。 2、胎盤細(xì)胞表型測定：取第3代細(xì)胞，以0.25％胰酶消化3min后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106，加入5μl小鼠血清封閉15min后，加入鼠抗人PE標(biāo)記的單克隆抗體CD13、C

7、D14、CD73、CD90、CD166、HLA-DR，及FITC標(biāo)記CD29、CD31、CD44、CD45、CD105、HLA-ABC抗體各20min，分別設(shè)PE、FITC、空白對照組，冰上避光反應(yīng)20min，PBS洗2次后，4℃1000r/min離心5min，棄上清后加入200μl冷PBS吹打混勻后，流式細(xì)胞儀檢測。 3、心肌細(xì)胞分化培養(yǎng)：采用懸滴法培養(yǎng)：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化并吹打成單個細(xì)胞后，制成2.5×104 ce

8、lls/ml細(xì)胞懸液，分化培養(yǎng)液為含有0.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青鏈霉素、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、20％胎牛血清的IMDM。細(xì)胞懸液以20μl/滴接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿蓋上，培養(yǎng)皿內(nèi)中放入10ml無菌PBS，蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中，3d后，從單個懸滴中吸出形成的懸浮擬胚體(embryonic bodies，Ebs)，轉(zhuǎn)入至預(yù)先以0.1％明膠涂抹的24孔

9、細(xì)胞培養(yǎng)板中。 4、檢測Ebs分化率：每天于顯微鏡下觀察Ebs的生長情況及出現(xiàn)跳動細(xì)胞的時間，以各組Ebs 中出現(xiàn)跳動心肌細(xì)胞為分化陽性，并分別與每組總的Ebs的數(shù)量相比，為分化率[10]。計數(shù)Ebs形成的第8d、9d、10d、11d、12d的分化率。 5、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測α-sarcomeric actin表達(dá)：將孔板內(nèi)分化細(xì)胞重新接種于新的孔板中，同時用未經(jīng)誘導(dǎo)分化的人胎盤干細(xì)胞作對照，待24 h細(xì)胞貼壁伸展后進(jìn)行檢

10、測：具體步驟按SABC染色試劑盒說明書操作，棄掉孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS(0.02mol/L，pH7.2-7.6)洗3遍，4％多聚甲醛固定30min，0.3％H2O2滅活內(nèi)源性酶，BSA封閉后分別加入1：200稀釋的小鼠抗人α-sarcomeric actin抗體，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，用生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗孵育1h，光鏡下觀察。 6、細(xì)胞免疫熒光檢測心肌特異性肌鈣蛋白表達(dá)：將孔板內(nèi)分化細(xì)胞重新接種于新的孔板中，同時用未經(jīng)

11、誘導(dǎo)分化的人胎盤干細(xì)胞作對照，待24h細(xì)胞貼壁伸展后進(jìn)行檢測：PBS洗3遍后，4％多聚甲醛固定30min，封閉液封閉30min，加入1：100稀釋的兔抗人cTnI抗體，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔1gG二抗(1：100)室溫避光孵育2h，PBS洗3遍，PI染核后封片，熒光顯微鏡下觀察。 7、RT-PCR檢測心肌特異性基因．Anf、β-MHC mRNA表達(dá)：收集第12d Ebs中跳動細(xì)胞的總RNA，用RT-PCR方法檢

12、測Anf、β-MHC mRNA，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。 結(jié)果： 1、組織塊培養(yǎng)11d左右，可見后有少量細(xì)胞爬出，隨著細(xì)胞數(shù)目的增多，貼壁的組織塊逐漸脫落，細(xì)胞呈漩渦狀生長或成簇生長，胞體變得細(xì)長，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)3W左右，細(xì)胞可達(dá)到80％融合，細(xì)胞經(jīng)傳代貼壁后，細(xì)胞變成梭形并逐漸形成干細(xì)胞集落。 2、流式細(xì)胞儀檢測顯示：來源于人胎盤組織的第3代細(xì)胞表達(dá)CD29、CD105，不表達(dá)CD13、CD14、

13、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD166、HLA-ABC、HLA-DR。 3、懸滴分化培養(yǎng)法培養(yǎng)3d后將形成的白色的Ebs接種到24孔培養(yǎng)板中，接種后5d(懸滴后8d)，于倒置顯微鏡下觀察到Ebs周圍可見到自發(fā)性節(jié)律收縮的心肌細(xì)胞團(tuán)，不同Ebs中的心肌合胞體顯示出的收縮性和形態(tài)有所不同。 4、α-橫紋肌肌動蛋白的細(xì)胞免疫化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒的陽性結(jié)果，陽性率為47.2％，與對照組(5.6

14、％)比較有顯著性差異(P<0.05)，而對照組胞漿染色呈陰性。 5、心肌特異性肌鈣蛋白I的細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)12d的細(xì)胞染色呈陽性，陽性率為41.8％，與對照組(1.2％)比較有顯著性差異(P<0.05)，胞漿發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，可見心肌細(xì)胞特征性橫紋結(jié)構(gòu)，而對照組胞漿染色呈陰性。 6、在第12d跳動的心肌細(xì)胞群中，可見心肌細(xì)胞特征性基因Anf、β-MHC表達(dá)。 結(jié)論： 1、胎盤中存在著豐富的干細(xì)胞

15、，不僅來源廣泛，且對其研究不會涉及倫理道德和法律問題，為人類提供了新的干細(xì)胞種子來源。 2、利用“懸滴-貼壁”培養(yǎng)法可誘導(dǎo)胎盤來源的干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，被誘導(dǎo)分化成有節(jié)律性跳動的心肌細(xì)胞群，且均不同程度表達(dá)各種心肌細(xì)胞特征性基因和心肌蛋白。 總之，采用“懸滴-貼壁”培養(yǎng)法將胎盤來源的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成節(jié)律性跳動的心肌細(xì)胞群，并且胎盤干細(xì)胞的提取對胎兒與母體均不產(chǎn)生損傷作用，對其研究不會涉及倫理法律問題，且來源廣泛，可以作