乙型重型肝炎血清中sTRAIL誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡作用研究.pdf

1、【研究背景】
　　乙型肝炎病毒HBV感染是我國重型肝炎的主要發(fā)病原因，其病情兇險，進(jìn)展迅速，死亡率高，因此近年來重型肝炎的發(fā)病機制及防治相關(guān)研究逐漸成為關(guān)注熱點。目前認(rèn)為重型肝炎肝衰竭的發(fā)病機制非常復(fù)雜，主要是病毒因素（病毒基因型差異、基因突變等）和宿主自身因素（宿主基因異常表達(dá)、免疫損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死等）及其相互作用的結(jié)果[1]。細(xì)胞凋亡在重型肝炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，主要可通過腫瘤壞死因子TNF-α，F(xiàn)asL，TRA

2、IL等及其相應(yīng)受體發(fā)揮促凋亡作用。TRAIL與TNFα及FasL有所不同的是TRAIL具有能促使感染后細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而不對正常細(xì)胞產(chǎn)生作用的特性，預(yù)示著TRAIL可能在乙型肝炎病毒感染所致重型肝炎或肝癌的發(fā)病機制中占有重要作用，近年來有不少研究者做過相關(guān)研究。
　　腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是近年來發(fā)現(xiàn)的TNF家族新成員[2]，分

3、為膜型和分泌型兩種，可在肺、脾臟、肝臟、前列腺、卵巢、小腸、結(jié)腸等多種組織及外周血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、感染后細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)?？扇苄蚑RAIL(soluble TRAIL，sTRAIL)為組織和細(xì)胞中的膜型TRAIL（memberane TRAIL，mTRAIL）分泌而來，是其胞外段C末端的同源三聚體亞單位結(jié)構(gòu)通過胞吐作用或被金屬蛋白酶切割而釋放到外周血中。膜型TRAIL與可溶型TRAIL具有相同的生物學(xué)功能，都能通過與死亡受體的結(jié)

4、合形成死亡結(jié)構(gòu)域從而誘發(fā)細(xì)胞的凋亡。TRAIL受體分為兩類[3]，死亡受體DR4、DR5和誘騙受體DcR1、DcR2、OPG。其中受體DR4和DR5的胞外段可與TRAIL結(jié)合形成死亡結(jié)構(gòu)域FADD，從而啟動細(xì)胞凋亡信號通路，是主要參與細(xì)胞凋亡的受體，因此被稱為死亡受體。已有研究[4]表明慢性乙型肝炎患者外周血中sTRAIL及PBMC上mTRAIL表達(dá)較健康對照明顯增加，能通過促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡，參與肝臟的病理損傷過程及炎癥反應(yīng)，并認(rèn)為與炎

5、性損傷因子如ALT,AST,膽紅素水平等呈相關(guān)性。也有研究[5-7]稱乙肝病毒蛋白也可不同程度地影響TRAIL的誘導(dǎo)凋亡作用，本實驗室前期研究結(jié)果[8]表明乙肝病毒蛋白HBx對人TRAIL基因表達(dá)有明顯的激活作用，其機制是通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子sp1的激活和核轉(zhuǎn)移，并與TRAIL基因啟動子上游順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)了TRAIL基因啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用。而目前sTRAIL在在乙型重型肝炎患者肝細(xì)胞凋亡中的作用及內(nèi)在機制尚不清楚。<

6、br>　　【研究目的】
　　本研究將深入探討乙型重型肝炎患者sTRAIL及相關(guān)受體DR4、DR5的表達(dá)以及相關(guān)的凋亡信號分子的表達(dá)及活性，并明確重型肝炎患者高表達(dá)的炎癥因子IL-6是否影響sTRAIL的誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡作用。
　　【研究方法】
　　1.收集乙型重型肝炎患者、輕度慢性乙型肝炎患者及健康對照者的外周血標(biāo)本和肝組織標(biāo)本；
　　2.用ELISA的方法檢測乙型重型肝炎患者血清中的sTRAIL的表達(dá)，分別以輕度

7、慢性乙型肝炎患者血清及健康者血清為對照；
　　3.用Realtime PCR、免疫組化、Western Blot的方法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測肝組織中TRAIL受體DR4和DR5的表達(dá)；
　　4.用免疫組化的方法檢測肝組織中凋亡相關(guān)分子caspase3、8、9的表達(dá)以觀察乙型重型肝炎患者肝細(xì)胞的凋亡情況；
　　5.分別用含80％乙型重型肝炎患者血清、80%慢性乙型肝炎患者血清、80%健康對照者血清及含10%FB

8、S DMEM培養(yǎng)基刺激肝癌細(xì)胞系Huh7，然后用抗sTRAIL抗體進(jìn)行阻斷，觀察各組細(xì)胞的凋亡率情況，通過體外實驗進(jìn)行驗證重型肝炎血清中sTRAIL的誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡作用；
　　6.用ELISA的方法檢測乙型重型肝炎患者血清中IL-6的表達(dá)，然后分別用不同濃度梯度的人IL-6重組蛋白與人sTRAIL重組蛋白（10ng/ml）共同刺激Huh7細(xì)胞，觀察細(xì)胞因子IL-6是否與sTRAIL的促肝細(xì)胞凋亡作用相關(guān)。
　　【研究結(jié)果】<

9、br>　　1. ELISA檢測血清中sTRAIL的表達(dá)結(jié)果提示乙型重型肝炎患者sTRAIL表達(dá)較慢性乙型肝炎組和健康對照組明顯增加（P＜0.01），sTRAIL濃度分別為2.525 ng/ml（2.525±2.687），0.624ng/ml(0.624±0.316)，0.848ng/ml(0.848±0.566)；
　　2. Realtime PCR，免疫組化和Western Blot的方法檢測肝組織中的DR4和DR5的mRNA水

10、平和蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果提示DR4和DR5無論是在mRNA水平還是蛋白水平均在乙型重型肝炎組表達(dá)最明顯。在乙型重型肝炎組、慢性乙型肝炎組和健康對照組中，DR4的mRNA相對表達(dá)量分別為：（0.038±0.028），（0.006±0.003），（0.012±0.096）；DR5的mRNA相對表達(dá)量分別為：（0.317±0.249），（0.025±0.019），（0.035±0.020）；DR4的免疫組化IOD SUM值分別為：（23970

11、.5±13213.7），（5243.3±5046.7），（1925.5±1653.8）；DR5的IOD SUM值分別為：（11676.8±6107.5），（2224.0±1705.9），（1897.1±1793.0）；DR4的Western Blot相對灰度值分別為：（0.107±0.037），（0.070±0.023），（0.040±0.012）；DR5的相對灰度值分別為：（0.402±0.179），（0.142±0.053），（0.

12、147±0.048）；
　　3.免疫組化檢測肝組織中凋亡相關(guān)分子caspase3、8、9的表達(dá)，結(jié)果提示乙型重型肝炎患者肝組織表達(dá)最明顯，在乙型重型肝炎組、慢性乙型肝炎組和健康對照組caspase3的IOD SUM值分別為：（34444.4±33403.8），（5594.4±2078.9），（1197.3±1150.9），caspase8的IOD SUM值分別為：（11832.9±4454.3），（6438.0±2105.7），（

13、532.9±649.6），caspase9的IOD SUM值分別為：（18313.6±11644.7），（7995.2±5320.7），（2036.3±1397.7）；
　　4.乙型重型肝炎血清組中，刺激后的Huh7細(xì)胞凋亡率明顯高于慢性乙型肝炎血清組、健康對照血清組和含10%FBS培養(yǎng)基組（P＜0.001），其中加乙型重型肝炎血清組細(xì)胞平均凋亡率為34.54%（34.54±8.57），慢乙肝血清組細(xì)胞凋亡率為15.35%（15.

14、35±3.34），健康對照血清組細(xì)胞平均凋亡率為12.33%（12.33±2.68），而加10%FBS培養(yǎng)基組細(xì)胞平均凋亡率為15.31%（15.31±4.24），用抗人sTRAIL中和抗體阻斷后各組細(xì)胞平均凋亡率分別為19.79%（19.79±3.03），10.59%（10.59±4.37），10.44%（10.44±3.3），11.91%（11.91±4.33），乙型重型肝炎血清組加sTRAIL中和抗體后細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.

15、001），而其他組加抗體后凋亡率無明顯改變；
　　5.乙型重型肝炎患者外周血中IL-6的表達(dá)較慢性乙型肝炎組和健康對照組明顯增加（P＜0.05)，其濃度分別為0.218ng/ml(0.218±0.302)，0.069ng/ml（0.069±0.015），0.102ng/ml(0.102±0.062)。通過不同濃度（0，6.25，12.5，25，50，100ng/ml）的人IL-6重組蛋白與sTRAIL重組蛋白（10ng/ml）共同

16、刺激Huh7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率較只加sTRAIL或只加IL-6組明顯增加，且與IL-6濃度呈正相關(guān)，隨著IL-6濃度的增加，細(xì)胞凋亡率分別為14.9%（14.9±1.6），17.9%（17.9±1.6），20.1%（20.1±1.8），23.2%（23.2±0.8），26.0%（26.0±0.97），38.3%（38.3±4.4）。
　　【研究結(jié)論】
　　以上研究表明：
　　1.乙型重型肝炎患者外周血中sTRAIL及