RNA干擾抑制ACP1對(duì)前列腺癌T3B細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建包含有ACP1小干擾RNA序列的真核表達(dá)載體，并將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染入前列腺癌T3B細(xì)胞中，檢測(cè)ACP1在pGenesiL-1/ACP1-shRNA轉(zhuǎn)染的T3B中的表達(dá)，研究ACP1基因被下調(diào)后，前列腺癌T3B細(xì)胞的生物學(xué)特性變化。
　　 方法：針對(duì)人ACP1基因開放閱讀框序列選擇干擾目的片段，據(jù)干擾目的片段設(shè)計(jì)小發(fā)卡狀RNA序列，人工合成設(shè)計(jì)好的片段，將合成片段與pGenesiL-1質(zhì)粒連接，構(gòu)成克隆質(zhì)粒。將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)

2、化入大腸桿菌DH5-α，進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)純化、酶切、測(cè)序鑒定插入片段完整正確。用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將pGenesiL-1/ACP1-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入T3B細(xì)胞，G418篩選得到穩(wěn)定克隆，以RT-PCR方法在mRNA水平檢測(cè)ACP1表達(dá)，以Western Blot方法檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。將細(xì)胞分為PC-3組、T3B組、pGenesiL-1轉(zhuǎn)染組、pGenesiL-1/ACP1-shRNA轉(zhuǎn)染組，通過MTT法測(cè)生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)

3、胞周期和凋亡，粘附實(shí)驗(yàn)測(cè)粘附能力，劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)遷移能力，Transwell法測(cè)侵襲能力。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了人ACP1-shRNA真核表達(dá)載體。篩選到成功轉(zhuǎn)染，并能穩(wěn)定表達(dá)的單克隆株，與對(duì)照組比較mRNA由0.45±0.03下降到0.09±0.02，蛋白相對(duì)表達(dá)由0.65±0.02下降到0.21±0.03，mRNA下調(diào)80%，蛋白下調(diào)76%，與對(duì)照組相比，下調(diào)ACP1后，前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期無明顯變化，粘附能力明顯下降，