Gli-1基因的RNAi對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：使用siRNA抑制核轉(zhuǎn)錄因子Gli-1基因的表達(dá)，篩選有效的干擾序列，觀察Gli-1基因的沉默對(duì)DU145細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲力的影響。為針對(duì)Gli-1基因的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)提供新的有效作用靶位，為針對(duì)Gli-1的前列腺癌基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：1.設(shè)計(jì)并體外化學(xué)合成3對(duì)針對(duì)Gli-1基因的特異性siRNA與1對(duì)綠色熒光標(biāo)記的FAM-siRNA作為陰性對(duì)照。
　　2.使

2、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將FAM-siRNA轉(zhuǎn)染入DU145細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀測(cè)siRNA的轉(zhuǎn)染效率。利用RT-PCR和Western Blot法分別檢測(cè)各組細(xì)胞Gli-1mRNA及蛋白的表達(dá)。計(jì)算表達(dá)率，選取具有最大抑制作用的siRNA作為最佳干擾序列。
　　3.將最佳干擾序列siRNA轉(zhuǎn)染入前列腺癌DU145細(xì)胞。用CCK-8(Cellcounting kit-8)法檢測(cè)siRNA對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響，Annexin V-PI法

3、檢測(cè)siRNA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，transwell小室法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后DU145細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：熒光顯微鏡下觀測(cè)，F(xiàn)AM-siRNA轉(zhuǎn)染效率達(dá)78％；RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Gli-1-siRNA的各組細(xì)胞的Gli-1 mRNA表達(dá)水平均低于陰性對(duì)照組與空白組，其中以siRNA-3轉(zhuǎn)染組作用最明顯，其Gli-1 mRNA表達(dá)率僅為(38.4±4.0)％；Western-blot法檢測(cè)也證實(shí)siRNA-3的作

4、用效果最佳，該組細(xì)胞Gli-1蛋白的表達(dá)率僅達(dá)(31.9±5.1)％；CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-3轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h的相對(duì)增殖率與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Annexin V-PI法檢測(cè)顯示，siRNA-3轉(zhuǎn)染組的早晚期凋亡細(xì)胞數(shù)分別是(19.0±2.2)個(gè)/HP和(17.0±2.7)個(gè)/HP，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，siR