H9N2 AIV影響小鼠NLRP3炎癥通路相關(guān)基因表達(dá)與分布的研究.pdf

1、H9N2亞型禽流感病毒可引起家禽的呼吸系統(tǒng)疾病，該病毒存在跨宿主傳播能力，并可與其它亞型的流感病毒重組形成新的流感病毒（如H7N9等），極大地威脅著人類的健康。炎癥反應(yīng)在機(jī)體對(duì)抗流感病毒感染中發(fā)揮著重要的作用。其中，NLRP3炎性小體及其相關(guān)通路基因在機(jī)體識(shí)別以及清除病毒的內(nèi)源性免疫進(jìn)程中，扮演重要角色。NLRP3相關(guān)信號(hào)通路的激活以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子及趨化因子有助于機(jī)體抑制并清除流感病毒，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞發(fā)揮作用對(duì)抗流感病毒的感染。但同

2、時(shí)，由此引發(fā)的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，又是造成機(jī)體病理性損傷及病毒高致死率的主要原因。IFITMs作為干擾素誘導(dǎo)刺激基因之一，以其重要的抗病毒活性被廣泛研究。NLRP3炎性小體及其相關(guān)通路基因H9N2禽流感病毒感染中發(fā)揮怎樣的調(diào)控機(jī)制？IFITMs能否在機(jī)體內(nèi)抑制H9N2禽流感病毒感染？H9N2亞型禽流感病毒PB2蛋白627位點(diǎn)的突變可否影響機(jī)體的內(nèi)源性免疫反應(yīng)？這些問題都亟待解決。因此，本研究以實(shí)驗(yàn)室研究流感病毒常用的BALB/c小鼠為模型

3、，分別從機(jī)體內(nèi)源性免疫的免疫調(diào)控機(jī)制及抗病毒機(jī)制這兩個(gè)不同方面，研究了野生型H9N2亞型禽流感病毒毒株（VK627）及其PB2蛋白627位點(diǎn)的單一突變株（rVK627E）感染對(duì)BALB/c小鼠機(jī)體內(nèi)源性免疫的影響。研究?jī)?nèi)容如下：
　　1. H9N2亞型禽流感病毒感染及其PB2蛋白627位點(diǎn)對(duì)BALB/c小鼠致病性的影響
　　攻毒后分別記錄不同組BALB/c小鼠的體重變化情況和死亡率，并取感染小鼠的肺組織制作病理切片進(jìn)行觀察。

4、結(jié)果顯示H9N2禽流感(VK627)毒株可感染BALB/c小鼠并引發(fā)相應(yīng)的臨床癥狀，包括體重顯著下降，嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎及細(xì)支氣管上皮細(xì)胞脫落和炎性滲出，并最終導(dǎo)致BALB/c小鼠死亡，具有高致死率。而PB2蛋白627位點(diǎn)單一突變可降低該毒株病毒毒力，感染小鼠不致死，相比與對(duì)照組，體重輕微下降，肺組織病變顯著輕微，且未見明顯炎性滲出物及脫落物。
　　2. H9N2流感病毒及其突變株感染對(duì)BALB/c小鼠肺NLRP3及其通路相關(guān)基因的

5、表達(dá)與蛋白組織分布的影響
　　分別采用熒光定量技術(shù)和免疫組化技術(shù)，檢測(cè)并比較對(duì)照組和攻毒組BALB/c小鼠肺組織內(nèi)RIP3、NLRP3、IL-1β及TNF-α基因表達(dá)及蛋白分布的變化。結(jié)果顯示，VK627組肺組織RIP3、NLRP3、IL-1β、TNF-α基因與蛋白的表達(dá)量均顯著高于rVK627E組，說(shuō)明H9N2亞型禽流感病毒VK627毒株及rVK627E毒株感染可不同程度地激活BALB/c小鼠的NLRP3及其通路相關(guān)基因，造成N

6、LRP3相關(guān)基因及其下游細(xì)胞因子表達(dá)量出現(xiàn)差異，這可能是造成BALB/c小鼠肺組織呈現(xiàn)不同程度病理?yè)p傷的潛在原因。
　　3. H9N2流感病毒及其突變株感染對(duì)BALB/c小鼠肺SLIT2/ROBO4基因表達(dá)及蛋白分布的影響
　　分別采用熒光定量技術(shù)和免疫組化技術(shù)，檢測(cè)并比較對(duì)照組和攻毒組BALB/c小鼠肺組織內(nèi)SLIT2/ROBO4基因表達(dá)及蛋白分布的變化。結(jié)果顯示，SLIT2/ROBO4基因與蛋白表達(dá)在rVK627E毒株感

7、染組上調(diào)，而在VK627毒株感組則被持續(xù)抑制，可能是VK627毒株感染引起的間質(zhì)性肺炎及細(xì)支氣管脫落及炎性滲出的程度強(qiáng)于rVK627E毒株的潛在原因之一，說(shuō)明SLIT2/ROBO4在BALB/c小鼠機(jī)體對(duì)H9N2亞型禽流感病毒感染引發(fā)的病理?yè)p傷進(jìn)程中，發(fā)揮潛在的抗炎功能。但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　4. H9N2流感病毒及其突變株感染對(duì)BALB/c小鼠各組織IFITM1/IFITM3表達(dá)譜的影響
　　分別采用熒光定量技

8、術(shù)和免疫組化技術(shù)，檢測(cè)并比較對(duì)照組和攻毒組BALB/c小鼠各組織內(nèi)IFITM1/IFITM3基因表達(dá)及蛋白分布的變化。結(jié)果顯示，IFITM1/IFITM3基因與蛋白廣泛分布于BALB/c小鼠心臟、肝、脾、肺、腎、腦等多個(gè)組織器官之中。兩株H9N2禽流感病毒感染后，IFITM1/IFITM3基因與蛋白表達(dá)譜會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。證實(shí)IFITM1/IFITM3基因在BALB/c小鼠機(jī)體多組織器官發(fā)揮潛在的抗H9N2禽流感病毒感染的功能；同時(shí)，H

9、9N2禽流感病毒PB2蛋白627位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)源性免疫機(jī)制及抗病毒機(jī)制發(fā)生變化。
　　本研究初步探究了NLRP3炎性小體及其相關(guān)通路基因在H9N2流感病毒感染誘導(dǎo)的機(jī)體內(nèi)源性免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制，證實(shí)H9N2禽流感病毒PB2蛋白627位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)源性免疫機(jī)制及抗病毒機(jī)制發(fā)生變化。同時(shí)，本研究首次探究了SLIT2/ROBO4在H9N2禽流感病毒感染引發(fā)的機(jī)體炎癥損傷中潛在的抗炎功能，并首次較全面闡釋了IFITM1/