NLRP3炎癥小體在淋巴瘤患者中的表達(dá)及相關(guān)功能研究.pdf

1、研究背景:
　　淋巴瘤是源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。隨著診療手段的不斷發(fā)展，患者的生存期和生活質(zhì)量得到了很大改善，仍有很大一部分淋巴瘤患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥，甚至導(dǎo)致死亡。淋巴瘤屬于免疫系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)生是多因素、多環(huán)節(jié)、多基因相互作用的結(jié)果，它與遺傳、免疫微環(huán)境的異常、抑癌基因的失活、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞異常增殖等有關(guān)。最近研究顯示，腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展或被化療藥物殺傷時(shí)，均可產(chǎn)生炎癥小體。炎癥小體是參與機(jī)體免疫的重要組成部分，NLRP3炎

2、癥小體是目前研究得最清楚的炎癥小體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化療耐藥中占據(jù)重要地位。
　　研究目的:
　　研究淋巴瘤患者NLRP3炎癥小體相關(guān)基因的多態(tài)性和表達(dá)，并評(píng)估其臨床意義，利用淋巴瘤細(xì)胞系進(jìn)行功能試驗(yàn)進(jìn)一步探索其功能并闡明其在淋巴瘤中的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1、淋巴瘤患者NLRP3相關(guān)基因SNPs檢測:選取390例淋巴瘤患者和385例健康對(duì)照者為研究對(duì)象，刮取淋巴瘤患者骨髓涂片，抽取健康對(duì)照者EDTA

3、抗凝全血，然后應(yīng)用DNA樣本提取試劑盒提取DNA，PCR（探針法）檢測IL-18(rs1946518)、IL-1β(rs16944)、CARD8(rs2043211)、NFκB94ins/del(rs28362491)各基因分型。
　　2、淋巴瘤患者及正常對(duì)照的NLRP3相關(guān)基因的表達(dá):選取68例淋巴瘤患者(46例新診斷的患者和22例緩解患者)和40例健康對(duì)照提取外周血mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用RT-PCR方法檢測

4、淋巴瘤患者和正常對(duì)照者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-18、IL-1β、caspase-1、NLRP3、ASC、NFκB基因mRNA水平的表達(dá)。應(yīng)用ELISA方法檢測淋巴瘤患者和健康對(duì)照外周血清中IL-18、IL-1β的水平。免疫組織化學(xué)方法檢測淋巴瘤患者淋巴瘤組織病理切片及正常淋巴結(jié)組織切片中NLRP3相關(guān)基因IL-18、NLRP3、ASC的表達(dá)。
　　3、在淋巴瘤細(xì)胞系Pfeiffe中加入LPS+ATP處理后，應(yīng)用Western b

5、lot法檢測ASC及NFκB蛋白的表達(dá)水平，以GAPDH作內(nèi)參。
　　4、設(shè)置地塞米松濃度梯度，觀察NLRP3炎癥小體活化對(duì)Pfeiffer細(xì)胞藥物敏感性影響。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)為對(duì)照組、LPS+ATP組、DEX組、DEX+LPS+ATP組，收集各組細(xì)胞和上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。應(yīng)用ELISA方法測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18和IL-1β的濃度，應(yīng)用RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞IL-18、IL-1β、caspase-1、NLRP3、

6、c-myc、TP53、bcl-2、bax基因mRNA水平的表達(dá)。
　　5、在Pfeiffer培養(yǎng)體系中加入IL-18和抗IL-18培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)為對(duì)照組、DEX組、IL-18+DEX組、抗IL-18+DEX組，收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。應(yīng)用RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞c-myc、TP53、bcl-2、bax基因mRNA水平的表達(dá)。
　　6、CCK8方法檢測各組細(xì)胞增殖情況，并進(jìn)行藥敏分析;根據(jù)細(xì)胞周期試劑盒說明

7、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析;使用Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞凋亡情況。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:將連續(xù)變量和分類變量用方差分析或非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)卡方檢驗(yàn)用于測試Hardy-Weinberg平衡的基因型頻率。通過計(jì)算優(yōu)勢比(OR)和相應(yīng)的95％置信區(qū)間(CI)來評(píng)估基因型與疾病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)。使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行RT-PCR和ELISA檢測的各組

8、結(jié)果之間的比較。Kaplan-Meier曲線用于描述存活。進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)三次，定量數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　一、NLRP3炎癥小體相關(guān)基因SNPs與淋巴瘤的易感性及預(yù)后的相關(guān)性研究
　　1、炎癥小體NLRP3相關(guān)基因多態(tài)性與淋巴瘤的易感性:淋巴瘤患者IL-18(rs1946518)和NFκ394ins/del(rs28362491)基

9、因型分布與正常對(duì)照具有顯著性差異。
　　2、L-18(rs1946518)和NFκB94ins/del(rs28362491)的等位基因與淋巴瘤的易感性:攜帶IL-18(rs1946518)等位基因“G”和NFκB94ins/del(rs28362491)等位基因“ins”者淋巴瘤患病風(fēng)險(xiǎn)均顯著增加。
　　3、NLRP3炎癥小體基因多態(tài)性與淋巴瘤患者臨床指標(biāo)相關(guān)性:IL-18(rs1946518)基因型與LDH水平相關(guān)，CA

10、RD8(rs2043211)基因型與性別、B癥狀和結(jié)外浸潤部位相關(guān)，NFκB94ins/del(rs28362491)與LDH水平、分型和骨髓浸潤相關(guān)。
　　4、IL-18(rs1946518)和NFκB94ins/del(rs28362491)與B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)易感性:IL-18(rs1946518)與T-NHL和B-NHL易感性均具有顯著相關(guān)性。而NFκ394ins/del(rs28362491)僅與B-NH

11、L的易感性顯著相關(guān)。攜帶IL-18等位基因“G”者，T-NHL和B-NHL患病風(fēng)險(xiǎn)均顯著增加。攜帶NF-kB等位基因“ins”者，B-NHL患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。
　　5、CARD8(rs2043211)的AA基因型及LDH水平較高的淋巴瘤患者具有較短的生存期。
　　二、NLRP3炎癥小體相關(guān)基因在淋巴瘤患者中的表達(dá)及相關(guān)功能研究
　　1、NLRP3炎癥小體相關(guān)基因表達(dá):NLRP3相關(guān)基因IL-18、IL-1β、caspa

12、se-1、NLRP3和NFκ3的mRNA表達(dá)在淋巴瘤患者中均明顯高于正常人，但治療后緩解淋巴瘤患者中只有IL-18mRNA表達(dá)明顯低于新診斷淋巴瘤患者，其它基因表達(dá)未見顯著性差異。IL-18(rs1946518)、NFκB94ins/del(rs28362491)、IL-1β(rs16944)基因不同基因型間mRNA表達(dá)均無顯著性差異。
　　2、淋巴瘤患者外周血血清IL-18以及IL-1β水平:新診斷的淋巴瘤患者的血清IL-18水

13、平顯著高于對(duì)照組，化療緩解后較化療前顯著降低。而新診斷的淋巴瘤患者血清IL-1β水平顯著高于對(duì)照組，但化療緩解后與化療前相比沒有顯著變化，IL-18(rs1946518)GT基因型患者的血清IL-18水平顯著高于GG基因型。
　　3、淋巴瘤病理組織中NLRP3相關(guān)基因表達(dá):淋巴瘤患者ASC和NLRP3表達(dá)明顯高于正常對(duì)照，IL-18表達(dá)略高于正常對(duì)照。
　　4、NLRP3炎癥小體活化驗(yàn)證:用LPS刺激6h，ATP作用1h后，

14、Pfeiffer細(xì)胞ASC和NFκB的蛋白表達(dá)水平升高，NLRP3相關(guān)基因IL-18、caspase-1、IL-1β、NLRP3的mRNA表達(dá)均升高，培養(yǎng)上清液中IL-18和IL-1β水平顯著升高，均提示NLRP3炎癥小體被活化。
　　5、NLRP3炎癥小體的活化增強(qiáng)了Pfeiffer細(xì)胞對(duì)地塞米松的耐藥性:LPS+ATP處理細(xì)胞后，地塞米松對(duì)Pfeiffer細(xì)胞的抑制率下降，顯著提高了地塞米松的IC50值。
　　6、NLR

15、P3炎癥小體減弱地塞米松對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用:地塞米松可抑制pfeiffer細(xì)胞增殖，NLRP3炎癥小體的活化促進(jìn)細(xì)胞周期從G1進(jìn)入S期，通過上調(diào)c-myc mRNA表達(dá)，減弱了地塞米松對(duì)細(xì)胞周期的影響，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　7、NLRP3炎癥小體抑制地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用:地塞米松可誘導(dǎo)pfeiffer細(xì)胞凋亡，NLRP3炎癥小體的活化通過上調(diào)bcl-2和下調(diào)Bax從而抑制細(xì)胞凋亡，減弱地塞米松的促凋亡作用。
　　8

16、、重組人IL-18(rhIL-18)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體對(duì)Pfeiffer細(xì)胞的生物學(xué)作用:加入rhIL-18后c-myc mRNA和bcl-2mRNA表達(dá)顯著增加，而TP53mRNA和bax mRNA表達(dá)顯著降低，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，抑制地塞米松的抗腫瘤作用，而加入抗IL-18后作用相反。
　　研究結(jié)論:
　　1、IL-18(rs1946518)和NFκB94ins/del(rs28362491)基因多態(tài)性是

17、影響淋巴瘤易感性的相關(guān)因素，CARD8(rs2043211)基因多態(tài)性對(duì)淋巴瘤的生存期有較大影響。
　　2、淋巴瘤患者NLRP3相關(guān)基因表達(dá)高于正常人，NLRP3炎癥小體通過其下游基因尤其是IL-18的作用，促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞增殖，抑制淋巴瘤細(xì)胞凋亡，減弱地塞米松的抗腫瘤作用。
　　3、IL-18可活化NLRP3，促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞增殖，抑制淋巴瘤細(xì)胞凋亡，減弱地塞米松的抗腫瘤作用?？笽L-18作用與之相反。
　　4、NLRP