H9N2亞型AIV受體結(jié)合特性分析及內(nèi)部基因?qū)χ虏⌒杂绊懙难芯?pdf

1、近十幾年來，禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)特別是H9N2亞型AIV在中國廣泛流行，給中國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。已有研究發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV不經(jīng)適應(yīng)即可感染哺乳動物，包括小鼠、豚鼠、雪貂、恒河猴等實驗動物以及家貓、家犬等伴侶性動物。更重要的是，我國已發(fā)生H9N2亞型禽流感感染人的事件。血清學(xué)調(diào)查也顯示，我國農(nóng)場從業(yè)人員的血清中抗H9亞型流感病毒的陽性率達2.3％-13.7％。上述現(xiàn)象說明H9N2亞

2、型AIV已經(jīng)獲得跨越種間屏障進而感染哺乳動物甚至是人的能力，因而具有引發(fā)新的流感大流行的潛在威脅。在廣泛流行的同時，H9N2亞型AIV作為新發(fā)流感病毒的基因節(jié)片供體為其它亞型AIV提供了多個基因節(jié)片。如1997年香港流行的H5N1亞型流感病毒，其內(nèi)部基因可能來源于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分離株，而2013年流行的H7N9亞型AIV的內(nèi)部基因全部來自H9N2亞型AIV。因此，加強對中國H9N2亞型AIV跨

3、種感染與致病機制研究，對保障養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展和保護人類健康具有重要的現(xiàn)實意義。
　　本研究從分析H9N2亞型AIV的受體結(jié)合特性與致病機制入手，主要進行了以下兩方面的工作:
　　首先，分析了中國近十幾年間流行的H9N2亞型AIV受體結(jié)合特性。我們分析了中國1999～2014年間在NCBI上提交的H9N2亞型AIV的HA序列與病毒受體結(jié)合能力有關(guān)的HA蛋白第226位點，同時對相應(yīng)病毒株的宿主分布進行了統(tǒng)計。結(jié)果表明，中國流行的H9N

4、2流感病毒其HA-226位點已呈現(xiàn)出遺傳演化的多樣性，除了常見的L和Q位點外，又出現(xiàn)了M和F，其所占比率分別為81.85％、17.57％、4.81％和0.11％;宿主分布結(jié)果表明，中國的H9N2亞型AIV絕大部分來自于禽類，剩下的分別來自于豬和人，其所占比率分別為97.92％、1.81％和0.27％。另外，分別利用雞紅細胞法和固相ELISA方法對實驗室保存的三株H9N2亞型AIV的受體結(jié)合能力進行了檢測。結(jié)果表明，具有HA-226L的病

5、毒（CK/JN/3）只具有結(jié)合SAα2，6Gal的能力;具有HA-226Q的病毒(CK/JL/6)只具有結(jié)合SAα2，3Gal的能力;而具有HA-226F的病毒(CK/JN/2)則具有雙重受體結(jié)合特性。而當(dāng)前中國家禽中所流行的H9N2亞型流感病毒以具有結(jié)合SAα2，6Gal的病毒為主。上述結(jié)果說明中國H9N2亞型AIV大部分毒株已具備了識別人樣流行病毒受體的能力，在哺乳動物間流行的風(fēng)險在加大。
　　另一方面，本實驗分析了H9N2亞

6、型AIV內(nèi)部基因突變對病毒致病性的影響。利用點突變技術(shù)將在小鼠適應(yīng)株中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)部基因3個氨基酸突變位點（PB2-E627K、 HA-N313D和HA-N496S）依次引入到母本野生株A/Chicken/JN/Li-2/2010(H9N2)相應(yīng)的基因序列中。通過反向遺傳操作技術(shù)獲得具有一個或多個突變位點的病毒株。結(jié)果表明，與母本毒相比，PB2-E627K突變位點的出現(xiàn)使病毒在MDCK細胞和小鼠肺臟內(nèi)的復(fù)制能力均增強，且差異顯著(p＜0.0

7、5）;而只具有HA-313D/496S病毒株的復(fù)制能力與母本毒株相似。在致病力方面，以106EID50攻毒小鼠時，具有PB2-E627K的病毒對小鼠的致死性增強，其MLD50至少提高了316倍;而母本毒與只具有HA-313D/496S的病毒株并不對小鼠致死。106EID50攻毒小鼠后肺臟病理檢測結(jié)果表明，具有PB2-E627K病毒的小鼠肺臟病變集中在小血管和細支氣管周圍，伴有水腫和炎性細胞浸潤，而母本毒與具有HA-313D/496S的病

8、毒株對應(yīng)的小鼠肺臟并無明顯的病理變化。聚合酶活性分析發(fā)現(xiàn)，具有PB2-E627K的毒株聚合酶活性至少提高了16倍，與母本毒相比差異顯著。病毒的酸、熱穩(wěn)定性未見明顯變化。以上結(jié)果說明，PB2-E627K是鼠適應(yīng)株致病性增強的關(guān)鍵氨基酸位點，并通過聚合酶活性的提高影響了病毒對宿主的致病性。
　　受體結(jié)合特性與致病性分析結(jié)果表明，H9N2亞型AIV具備了識別人類上呼吸道流感病毒受體的能力，并可通過單個氨基酸的突變獲得對哺乳動物的高致病性