Fruitless在家蠶求偶行為中的功能研究.pdf

1、求偶行為是動物交配的必需步驟，對動物的繁衍有著重要意義。fruitless是昆蟲求偶行為中的關鍵基因。在模式昆蟲果蠅中，fruitless主要通過調(diào)控與求偶相關的神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量，從而促使雄性果蠅進行求偶行為。家蠶作為一種重要的鱗翅目模式昆蟲，關于fruitless基因研究未見報道。
　　本研究選取了家蠶fruitless基因作為研究對象。首先，對fruitless進行了克隆，序列比對和信息分析，利用RT-PCR分析了其組織和時期

2、表達特征。通過原核表達獲得了fruitless的重組蛋白，進一步制備了fruitless的多克隆抗體，然后利用多克隆抗體檢測了fruitless在家蠶體內(nèi)的存在形式，同時進行了亞細胞定位和組織定位；還利用了RNA干涉技術，對家蠶個體進行了干涉實驗；最后利用免疫沉淀技術，獲得一些潛在的與fruitless相結合的蛋白。主要結果如下：
　　1、家蠶fruitless的克隆、序列分析和表達譜；
　　本研究將果蠅Fruitless蛋

3、白質(zhì)序列在家蠶數(shù)據(jù)庫SilkDB上進行同源檢索，結果發(fā)現(xiàn)編號為BGIBMGA006492-TA的預測基因，其定位于家蠶的第6號染色體上。根據(jù)預測基因序列設計引物，以家蠶成蟲頭部cDNA為模板進行基因進行克隆，結果顯示，fruitless基因在家蠶中有兩種剪切形式，第一種剪切形式含7個外顯子，共927 bp；第二種剪切形式含4個外顯子，共330 bp（第二種剪切形式在330 bp處，含有終止密碼子）。結構域預測結果顯示fruitless基

4、因編碼蛋白質(zhì)是含有一個BTB結構域和兩個zinc finger結構域的蛋白質(zhì)。表明fruitless可能作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。RT-PCR結果表明，兩種剪接形式在雌雄家蠶的各種組織和蛹期中均有表達。
　　2、家蠶fruitless的原核表達和抗體制備；
　　通過對fruitless的序列分析，設計了表達引物，將目的片段亞克隆到pET-28a載體上，測序成功后轉(zhuǎn)化到表達菌株Transetta（DE3）內(nèi)，表達檢測發(fā)現(xiàn)fruit

5、less的兩種剪接形式均以包涵體形式表達。于是進行了蛋白純化，得到較高純度的蛋白，送到公司制備得到fruitless的多克隆抗體?？贵w特異性檢測結果顯示，制備的多克隆抗體特異性良好。
　　3、家蠶fruitless的蛋白水平的時空表達分析；
　　利用制備的多克隆抗體，檢測到fruitless在家蠶的各個組織中均有表達。而在蛹期fruitless的表達有逐漸增加的趨勢。對fruitless蛋白質(zhì)在細胞中的表達進行了定位，發(fā)現(xiàn)f

6、ruitless在細胞質(zhì)中表達。根據(jù)fruitless的結構域分析，推測其在個體水平上可能是通過與一些轉(zhuǎn)運因子等的結合，轉(zhuǎn)運到細胞核中進而參與了基因的調(diào)控，從而發(fā)揮作用。同時也對fruitless在家蠶幼蟲的腦中進行了組織定位，發(fā)現(xiàn)其主要分布在腦部神經(jīng)元的周圍，和左右兩小腦的中間部位的有較高量的表達。
　　4、家蠶fruitless的功能探究；
　　根據(jù)家蠶fruitless序列合成雙鏈RNA，在蛹期對家蠶進行干涉，同時，利

7、用定量PCR和Western blot實驗對干涉效果進行檢測，結果顯示個體中fruitless基因下調(diào)。通過觀察干涉組家蠶和對照組家蠶的求偶行為，發(fā)現(xiàn)干涉后的一部分家蠶未能完成交配（在60 min內(nèi)），而完成交配的家蠶其求偶的時間大多超過10 min。干涉后的家蠶求偶的時間延遲，交配率降低。這些結果說明fruitless在家蠶的求偶行為中發(fā)揮著重要作用。
　　5、家蠶Fruitless相互結合蛋白的篩選。
　　通過免疫沉淀實

8、驗，找到與對照組差異的蛋白條帶。進一步對差異條帶進行質(zhì)譜鑒定，共鑒定出127組，包括327種蛋白。主要分為了4類蛋白，第一類是與神經(jīng)相關的蛋白，第二類是與細胞周期相關蛋白，第三類是與卵的形成相關蛋白，第四類是功能未知的蛋白。其中，erine/arginine repetitive matrix protein2，pheromone biosynthesis activating neuropeptide receptor，是與神經(jīng)相關的