BmGem1和BmGem2在家蠶細(xì)胞中的功能鑒定.pdf

1、細(xì)胞周期活動(dòng)是一個(gè)普遍而又非常復(fù)雜的級(jí)聯(lián)調(diào)控過(guò)程，它與細(xì)胞的增殖和分化、DNA的損傷和修復(fù)以及個(gè)體的發(fā)育、器官的形成、壞死組織的再生和疾病的發(fā)生密切相關(guān)。多細(xì)胞生物的正常發(fā)育依賴(lài)于細(xì)胞增殖及分化的一系列嚴(yán)密調(diào)控過(guò)程，研究表明多種蛋白在這一過(guò)程中起著非常重要的作用。Geminin蛋白就是其中一種，它是1998年首先在爪蟾卵的抽提物中被鑒定到的一個(gè)不穩(wěn)定小分子核蛋白。Geminin包含一段特殊的coiled-coil超螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)

2、性結(jié)合DNA復(fù)制起始因子Cdt1或多種參與細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控個(gè)體發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的增殖和分化。目前，Geminin作為偶聯(lián)細(xì)胞增殖與分化的一個(gè)關(guān)鍵的周期調(diào)控因子已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。本研究在本實(shí)驗(yàn)室已克隆并鑒定的兩個(gè)家蠶Geminin基因，BmGem1和BmGem2以及復(fù)制起始因子BmCdt1的基礎(chǔ)上，利用免疫共沉淀、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)、基因干擾和過(guò)表達(dá)技術(shù)以及酵母雙雜交技術(shù)等多種分子細(xì)胞生物學(xué)研究方法對(duì)其在細(xì)胞中的功能展開(kāi)深入的研

3、究，這將為家蠶細(xì)胞周期調(diào)控的研究奠定基礎(chǔ)，并且能夠豐富細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)理論。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.BmGem1、BmGem2與BmCdt1之間的相互作用關(guān)系
　　本研究通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)的方法對(duì)BmGem1、BmGem2以及BmCdt1蛋白之間的相互作用關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)。在家蠶卵巢細(xì)胞系BmN-SWU1中BiFC和Co-IP結(jié)果表明:BmGem1和BmGem2在細(xì)胞核中自身都能

4、相互作用，并且BmGem1和BmGem2之間也存在相互作用;在細(xì)胞核中BmGem1能與BmCdt1發(fā)生相互作用，而B(niǎo)mGem2不能與BmCdt1發(fā)生相互作用，但是BmGem2能在細(xì)胞質(zhì)中與BmCdt1發(fā)生相互作用。另外，Co-IP檢測(cè)結(jié)果顯示:當(dāng)BmGem1、BmGem2和BmCdt1在家蠶BmN-SWU1細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)中BmGem1與BmGem2都能與BmCdt1發(fā)生相互作用，不存在相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的關(guān)系，在細(xì)胞核中BmGem

5、1與BmCdt1能發(fā)生相互作用，而B(niǎo)mGem2不能與BmCdt1相互作用。這些研究結(jié)果表明，BmGem1是家蠶細(xì)胞直接與BmCdt1相互作用的 Geminin蛋白直系同源物，而B(niǎo)mGem2在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用以及執(zhí)行的功能的分子機(jī)制可能與Geminin蛋白存在差異。
　　2.BmGem1和BmGem2干涉對(duì)家蠶細(xì)胞的影響
　　利用基于家蠶miRNA-based的RNAi載體在家蠶卵巢細(xì)胞系BmN4細(xì)胞中對(duì)BmGem1和Bm

6、Gem2表達(dá)進(jìn)行敲降。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明BmN4細(xì)胞中轉(zhuǎn)染BmGem1RNAi載體后，在對(duì)照組(conlRNAi)BmGem1和BmGem2基因表達(dá)量為1的基礎(chǔ)上， BmGem1的mRNA水平下降為0.39±0.01，BmGem2的mRNA水平則升高為1.28±0.01;而轉(zhuǎn)染BmGem2 RNAi后在對(duì)照組(con2RNAi) BmGem2和BmGem1基因表達(dá)量為1的基礎(chǔ)上，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明BmGem2的mRNA水

7、平下降為0.61±0.07，BmGem1的mRNA水平則升高為1.66±0.04，同時(shí)干涉BmGem1和BmGem2后在對(duì)照組(conRNAi) BmGem1和BmGem2基因表達(dá)量為1的基礎(chǔ)上，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明BmGem1的mRNA水平下降為0.78±0.05，BmGem2的mRNA水平下降為0.68±0.06，這些研究結(jié)果表明兩者之間存在一定的劑量補(bǔ)償?shù)年P(guān)系，暗示兩個(gè)蛋白雖然與BmCdt1作用機(jī)制存在差異，但在家蠶細(xì)胞中的

8、功能仍然存在一定關(guān)聯(lián)。
　　BmN4細(xì)胞中BmGem1干涉后細(xì)胞體積明顯的增大，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明BmGem1干涉組中有58.35％左右的細(xì)胞體積增大，對(duì)照組中僅有5.24％左右的細(xì)胞體積增大的細(xì)胞;BmGem2干涉組中未發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞體積增大的現(xiàn)象;但是同時(shí)干涉BmGem1和BmGem2后細(xì)胞體積增大的現(xiàn)象更為顯著，達(dá)到被干涉細(xì)胞的87.35％左右，顯著高于BmGem1單獨(dú)干涉組。細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果顯示BmGem1干涉的家蠶細(xì)

9、胞中細(xì)胞增殖活性下降了36％左右，而B(niǎo)mGem2干涉的BmN4細(xì)胞中細(xì)胞增殖活性沒(méi)有明顯的變化;Bm Gem1和BmGem2共同干涉后細(xì)胞的增殖活性下降了53％左右，與BmGem1單獨(dú)干涉組相比增殖活性顯著下降。另外，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，BmGem1干涉后誘發(fā)DNA重復(fù)復(fù)制現(xiàn)象，而B(niǎo)mGem2干涉則不能誘發(fā)這種現(xiàn)象。并且與單獨(dú)干涉BmGem1相比，BmGem1和BmGem2共同干涉后誘發(fā)家蠶細(xì)胞DNA重復(fù)復(fù)制現(xiàn)象更顯著。說(shuō)明BmGem

10、1蛋白在家蠶細(xì)胞中能與BmCdt1蛋白直接相互作用調(diào)控細(xì)胞中DNA復(fù)制的起始，細(xì)胞缺失BmGem1表達(dá)誘發(fā)DNA重復(fù)復(fù)制的發(fā)生，致使細(xì)胞核體積變大;BmGem2不能與BmCdt1直接相互作用，其缺失表達(dá)并不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程中DNA重復(fù)復(fù)制;而兩者同時(shí)缺失時(shí)抑制細(xì)胞增殖和誘發(fā)DNA重復(fù)復(fù)制能力增強(qiáng)，暗示BmGem2仍然參與調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)過(guò)程，但BmGem2在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用能夠被BmGem1替代。
　　3.BmGem1和B

11、mGem2過(guò)表達(dá)對(duì)家蠶細(xì)胞的影響
　　在BmN4細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)BmGem1和BmGem2基因后，熒光顯微鏡下觀察單個(gè)細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯的變化;但是BmGem1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照相比細(xì)胞密度明顯下降，細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞增殖活性下降了40％左右;而B(niǎo)mGem2過(guò)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖活性沒(méi)有明顯的變化;細(xì)胞流式結(jié)果表明，BmGem1過(guò)表達(dá)后G1期的細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有明顯的變化，S期的細(xì)胞數(shù)目顯著增加，G2/M期的細(xì)胞數(shù)目則顯著降低;而B(niǎo)mGe

12、m2過(guò)表達(dá)后各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞數(shù)目都沒(méi)有明顯的變化。這表明BmGem1過(guò)表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯在S期，而不能進(jìn)入G2/M期，過(guò)表達(dá)BmGem2對(duì)細(xì)胞周期沒(méi)有明顯的影響。
　　BmN4細(xì)胞轉(zhuǎn)染BmGem1和BmGem2過(guò)表達(dá)載體后利用Brdu標(biāo)記DNA復(fù)制起始情況，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)BmGem1的細(xì)胞中具有DNA復(fù)制活性的細(xì)胞為0.16±0.09，對(duì)照組細(xì)胞為0.51±0.07，BmGem1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的DNA合成活性顯著降低;而過(guò)表

13、達(dá)BmGem2的DNA合成活性沒(méi)有顯著差異。過(guò)表達(dá)研究結(jié)果表明，BmGem1在家蠶細(xì)胞周期進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用，BmGem1過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)行并抑制細(xì)胞增殖;而B(niǎo)mGem2在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用較弱，它的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行及細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。
　　4.BmGem2相互作用蛋白的篩選及鑒定
　　我們的前期研究結(jié)果顯示，BmGem2在DNA復(fù)制起始及細(xì)胞周期調(diào)控中的作用與BmGem1蛋白存在顯著差異，為了精確分析BmGem

14、2在家蠶細(xì)胞中執(zhí)行的相關(guān)功能，我們通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)鑒定家蠶中與BmGem2相互作用的蛋白。利用胚胎期、5齡第3天、游走期以及化蛹期的整蠶的總RNA構(gòu)建家蠶酵母雙雜交文庫(kù)。并以BmGem2為誘餌蛋白，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)共篩選獲得能夠與BmGem2發(fā)生相互作用的陽(yáng)性克隆34個(gè)，分別編碼23個(gè)基因，剔除這23個(gè)基因中因重組cDNA造成的移碼錯(cuò)義的基因，最終我們獲得陽(yáng)性克隆數(shù)是12個(gè)，隨后我們對(duì)這12個(gè)基因進(jìn)行克隆鑒定。通過(guò)雙重免疫熒光檢測(cè)和

15、免疫共沉淀方法，最終鑒定到4個(gè)基因（17號(hào)，21號(hào)，38號(hào)，39號(hào)）分別能夠與BmGem2共定位且產(chǎn)生相互作用。
　　生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，17號(hào)和39號(hào)基因編碼的蛋白是家蠶中特異的蛋白，序列分析結(jié)果顯示在其它物種中未鑒定到其同源物。而21號(hào)基因編碼的蛋白是果蠅中Centrosomin蛋白的同源物，因此將21號(hào)基因命名為Bmcnn，研究表明Centrosomin參與細(xì)胞骨架調(diào)控并對(duì)于染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著很重要作用，qRT-PCR檢

16、測(cè)結(jié)果顯示Bmcnn在家蠶5齡第3天正在進(jìn)行高強(qiáng)度有絲分裂的精巢和卵巢中高表達(dá)，而在核內(nèi)有絲分裂旺盛的絲腺中幾乎不表達(dá)，推測(cè)BmGem2可能與細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)的調(diào)控有關(guān)。39號(hào)基因編碼的蛋白是哺乳動(dòng)物核糖體生物合成調(diào)控蛋白R(shí)RS1的同源物，將39號(hào)基因命名為BmRRS1，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示BmRRS1在家蠶5齡第3天的各個(gè)組織都有表達(dá)，且在精巢、卵巢和絲腺中表達(dá)量較高，推測(cè)BmGem2可能與核糖體生物合成調(diào)控有關(guān)。這些研究結(jié)果表明