Bmo-let-7在家蠶化蛹過程中的功能研究.pdf

1、昆蟲是種類最豐富的種群,與人類生產、生活密切相關。昆蟲的發(fā)育是昆蟲研究中的重要研究領域。昆蟲分為不完全變態(tài)昆蟲和完全變態(tài)昆蟲。完全變態(tài)昆蟲的外形和生理特點在生命周期各個階段都有很大差異。家蠶是完全變態(tài)昆蟲,一生經歷卵、幼蟲、蛹和成蟲四個階段.這些不同階段的時序發(fā)育機制還不清楚。作為重要的經濟昆蟲和鱗翅目的模式生物,對家蠶發(fā)育調控的研究在蠶桑產業(yè)和鱗翅目害蟲防治方面都有著十分重要的意義。
　　 Let-7是首先發(fā)現的microRN

2、As之一,在線蟲、果蠅、斑馬魚、人類等許多物種中都高度保守。家蠶中首先被實驗驗證的microRNA也是let-7。Let-7在家蠶中的表達與在其他物種中的表達模式類似,都高量表達于個體發(fā)育后期。本文著重探究了let-7是否調控家蠶幼蟲到蛹的發(fā)育過程,并對其靶基因進行了實驗驗證。
　　 Let-7表達量改變后,家蠶的化蛹過程受到影響。Let-7表達量提高后家蠶化蛹過程受到抑制。Let-7具有抑制細胞分裂,促進分化和成熟的作用;而R

3、as激活突變會導致細胞的分裂更加旺盛。Let-7有可能是通過抑制Ras來發(fā)揮其功能。
　　 1.改變let-7表達量對家蠶化蛹的影響
　　 家蠶從幼蟲到蛹的轉變要經歷一個過渡時期,即預蛹期。在預蛹期上調let-7將阻礙家蠶化蛹,而一定程度下調并不影響家蠶化蛹。陰性對照、突變let-7的種子堿基都不會影響家蠶化蛹。綜合以上實驗證明是let-7上調導致家蠶不能化蛹。
　　 2.檢測let-7及RasmRNA表達

4、>　　 Let-7mimics能夠上調let-7,而let-7antagomir能夠下調let-7。Let-7上調水平隨let-7mimics劑量提高而上升。Let-7表達變化并不明顯改變Ras的轉錄水平。
　　 3.檢測Ras蛋白豐度
　　 克隆Ras基因編碼區(qū),原核表達,純化后制備多克隆抗體。改變Let-7表達量后檢測Ras蛋白的表達,發(fā)現let-7上調后Ras2和Ras3蛋白含量有所降低,Rasl蛋白含量沒有明顯

5、變化。由此表明Ras2和Ras3可能是let-7的靶基因。
　　 4.驗證Ras3'UTR的let-7結合位點
　　 MicroRNAs調控靶基岡可以通過兩種方式:直接結合靶位點或通過其他基因間接調控靶基因。MicroRNAs通常是與靶基因3'UTR上的靶位點相結合米調控靶基因表達。通過預測發(fā)現let-7在Ras1、Ras2和Ras3的3'UTR上分別有2個、2個和5個結合位點。
　　 連有Ras23'UTR的熒