骨髓間充質(zhì)干細胞對實驗性自身免疫性重癥肌無力的治療作用及可能機制.pdf

1、目的:
　　 1、建立Lewis大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的分離、培養(yǎng)及鑒定的方法，探討β-巰基乙醇定向誘導其向神經(jīng)樣細胞分化的可行性，并觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE、膠質(zhì)纖維酸性蛋白酶GFAP的表達。
　　 2、腹腔輸注mAb35以探討建立實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMGExperimental autoimmune myasthenia gravis)的方法。
　　 3、探討骨髓間充質(zhì)干細胞(B

2、MSCs)對實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)的治療作用及TSG-6（tumor necrosis factor alpha-stimulated gene-6）、MMP-9在其作用中發(fā)揮的可能機制，為其應用于臨床治療提供一定的理論依據(jù)及實驗基礎。
　　 方法:
　　 1、BMSCs用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)獲得，觀察所培養(yǎng)的細胞形態(tài)，通過流式檢測細胞表面的CD90、CD29、CD45等標志抗原的表達率，然后用化學誘導劑

3、β-ME定向誘導干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化，對誘導后的細胞行免疫細胞化學和WB檢測，觀察細胞表面NSE及GFAP的表達情況，與未誘導細胞進行對比。
　　 2、本實驗建立EAMG動物模型的方法選用的是腹腔輸注mAb35，其是一種AChR特異性單克隆抗體，動物成功建模后應用HE染色法觀察兩組大鼠腓腸肌冰凍切片中炎性細胞的浸潤情況，并且應用免疫熒光技術(shù)觀察大鼠肌肉切片中的AChR數(shù)量的改變情況，并分別收集兩組大鼠的血清，采用間接ELIS

4、A方法檢測兩組大鼠血清中AChR-Ab含量。
　　 3、選取清潔級環(huán)境下飼養(yǎng)的Lewis雌性大鼠30只，將其分為BMSCs移植組(n=10)、EAMG模型對照組(n=10)和正常對照組(n=10)。移植組和模型對照組腹腔注射mAb35建立EAMG模型。分離培養(yǎng)Lewis大鼠的BMSCs進行鑒定后，調(diào)整密度至1.5×106/600μL PBS，移植組尾靜脈注射細胞懸液600μL，模型對照組和正常對照組同期給予600μL PBS。對

5、3組動物進行Lennon臨床評分，實驗結(jié)束時ELISA法檢測血清中AChR-Ab含量，免疫熒光技術(shù)觀察腓腸肌AChR數(shù)量的變化，應用real time RT-PCR研究腓腸肌AChRα、MMP-9 mRNA的表達。體外用10ng/ml TNF-α培養(yǎng)BMSCs24h后用ELISA檢測細胞上清TSG-6，并用realtime PCR檢測細胞內(nèi)TSG-6 mRNA表達的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1、倒置相差顯微鏡下的BMS

6、Cs形態(tài)以長梭形為主，流式細胞儀結(jié)果示細胞表面標記物CD90、CD29、CD45的表達率分別為99.04％、98.53％、0.01％;化學誘導劑β巰基乙醇誘導后的細胞其細胞形態(tài)發(fā)生了相應的變化，原本呈長梭形的細胞胞體收縮成球形或者不規(guī)則形狀，顯微鏡下所見細胞的折光性較前有明顯增強，較多的長突起出現(xiàn)在細胞胞體上，顯微鏡下這些突起類似于神經(jīng)元樣細胞的樹突和軸突;免疫細胞化學染色示NSE陽性表達率為57.6％±8.2％，而GFAP表達為陰性;

7、WB結(jié)果示誘導后細胞NSE表達量增加。
　　 2、實驗通過腹腔被動輸注mAb35上清成功建立了EAMG大鼠動物模型，該方法的成模率為100％，光鏡下發(fā)現(xiàn)PTMG組肌肉冰凍切片中炎性細胞浸潤增多，熒光顯微鏡下可見PTMG組肌肉切片中AChR表達量明顯下調(diào)，ELISA法檢測結(jié)果示PTMG組血清中的AChR-Ab含量明顯高于健康對照組。
　　 3、移植組Lennon評分、AChR-Ab含量、AChR mRNA表達均低于模型對照

8、組(P＜0.05);免疫熒光檢測示模型對照組未見紅色熒光，移植組大鼠可見斷斷續(xù)續(xù)較為微弱的熒光;TNF-α處理的BMSCs分泌的TSG-6含量明顯增高(P＜0.01)，TSG-6 mRNA表達量也增高(P＜0.05);模型對照組MMP-9表達提高（vs正常對照組P＜0.05）;而移植組vs正常對照組差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、全骨髓培養(yǎng)法可以獲得穩(wěn)定且高純度的BMSCs;β-巰基乙醇能夠在體外定向誘導培養(yǎng)