骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的治療

1、收稿日期：收稿日期：20160428錄用日期：錄用日期：20160815基金項(xiàng)目：基金項(xiàng)目：福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015S14118）通信作者：通信作者：jiachunfeng_fj@doi:10.6043j.issn.04380479.201604056骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠的治療作用研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠的治療作用研究賈春鋒1，邵林2，戴慶辰1，樂(lè)立盛2（1.廈門(mén)大學(xué)附屬福州第二醫(yī)

2、院福建福州350007；2.福州市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)醫(yī)院福建福州350007）摘要：摘要：為了探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的治療作用，將36只小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只。分別為正常對(duì)照組、模型組和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）組。采用不同方法治療，治療8周后，采用蘇木精伊紅（HE）染色觀察小鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)改變；RTPCR和Westernblot分別檢測(cè)小鼠脊髓組織中細(xì)胞因子IL1、IL2、IL4、IL6、IL10

3、、IL12、TNFα和IFNγ的mRNA水平和蛋白水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組IL1、IL2、IL12、TNFα和IFNγ的mRNA水平和蛋白水平上調(diào)（p＜0.05），而IL4和IL10下調(diào)（p＜0.05）；與模型組比較，BMMSCs組IL1、IL2、IL12、TNFα和IFNγ的mRNA水平和蛋白水平下調(diào)（p＜0.05），而IL4和IL10上調(diào)（p＜0.05）。對(duì)照組脊髓組織的結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完好；模型組脊髓組織局部出現(xiàn)

4、明顯空洞，而且瘢痕組織、神經(jīng)細(xì)胞非常稀少；BMMSCs組脊髓組織內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯空洞及瘢痕組織，而且有大量神經(jīng)細(xì)胞，可見(jiàn)清晰細(xì)胞胞體和突起。由上述結(jié)果可知，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠具有治療作用，其機(jī)理與抑制炎性蛋白的表達(dá)，減少變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎對(duì)脊髓的損傷有關(guān)。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；炎性蛋白中圖分類(lèi)號(hào)：中圖分類(lèi)號(hào)：R33文獻(xiàn)標(biāo)志碼：文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experim

5、entalallergicencephalomyelitis，EAE）是常見(jiàn)的多發(fā)性硬化（multiplesclerosis，MS）疾病，MS的發(fā)病特點(diǎn)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c(diǎn)的自身免疫病[1]。嚴(yán)重影響患者的生活，給患者及其家屬帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)和心里壓力。但對(duì)這方面的研究目前并不多，需要進(jìn)行詳細(xì)的研究。本研究擬建立EAE小鼠模型，采用BMMSCs尾部靜脈注射進(jìn)行治療，HE染色觀察小鼠脊髓病理形態(tài)變化，RTPCR和We

6、sternblot檢測(cè)小鼠脊髓組織中白介素1（IL1）、白介素2（IL2）、白介素4（IL4）、白介素6（IL6）、白介素10（IL10）、白介素12（IL12）、腫瘤壞死因子α（TNFα）和干擾素γ（IFNγ）水平表達(dá)的變化。初步探討B(tài)MMSCs治療EAE的作用機(jī)制，為臨床治療MS提供新的思路和有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。min，72℃1min，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)

7、物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶，并采用灰度分析軟件進(jìn)行分析。表1各種炎癥因子引物序列Tab.1Sequencesofinflammatycytokines炎癥因子引物序列上游：5CCAAGACCAGGTACCATG3IL1下游：5GGTTCTGGTCCATGGTAC3上游：5GCCAGGGTTTTCCCAGT3IL2下游：5ACTGGGAAAACCCTGGC3上游：5CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGG3IL4下游：5CCAA

8、CACAATGGCGCGCTTCCCGAG3上游：5ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC3IL6下游：5GCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTAT3上游：5TCAGTGTTAGACTAGTAAATT3IL10下游：5AATTTACTAGTCTAACACTGA3上游：5CCAAGACCAGGTACCATG3IL12下游：5CATGGTACCTGGTCTTGG3上游：5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3

9、TNFα下游：5CTGAGCCAGGATCAAACTCT3上游：5CTCCGAGATCTGGACGAG3IFNγ下游：5CTCGTCCAGATCTCGGAG3上游：5AGTTGCGTTACACCCTTTC3βactin下游：5CCTTCACCGTTCCAGTTT31.3.2Westernblot檢測(cè)小鼠脊髓組織中各種炎癥因子的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)小鼠脊髓組織中各種炎癥因子的蛋白表達(dá)水平[5]小鼠脊髓組織細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，采用各種炎癥因子的蛋白

10、抗體，37℃孵育36h，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，然后用蛋白裂解液使細(xì)胞裂解，放置于冰上保持5min后，樣品加入14體積的4蛋白上樣緩沖液，沸水煮沸5min，進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用含按約0.1mLcm2量加入封閉液封閉1h，一抗4℃過(guò)夜。次日PBST漂洗3次，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，ECL顯色。用SDSPAGE進(jìn)行電泳，并將其轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上。對(duì)抗體孵育處理，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法曝光后觀察