氨基葡萄糖硫酸鹽和小檗胺誘導白血病K562細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、白血病是一類臨床常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，現(xiàn)代常規(guī)治療方法的效果已達到一平臺期，大部分患者由于不能耐受化療藥物的毒副作用或者因白血病細胞對化療藥物的耐藥而導致治療失敗。目前誘導白血病細胞凋亡是治療白血病的策略之一，因此尋找高效低毒的自血病細胞誘導劑顯得尤為迫切。腫瘤凋亡機制的深入研究，將為治療惡性腫瘤奠定良好的基礎。 氨基葡萄糖硫酸鹽(glucosamine，GS)是氨基葡萄糖的一種重要衍生物，是人體內合成氨基粘性多糖、糖蛋白、糖

2、脂等大分子的重要原料。最近實驗研究揭示了GS一種新的生物學作用，研究曾發(fā)現(xiàn)氨基葡萄糖及其鹽酸鹽可誘導K562細胞向巨噬細胞方向分化，其硫酸鹽可誘導K562細胞的凋亡。GS來源于自然生物，安全可靠，毒副作用?。痪哂斜韧惍a品更高的生物利用度；具有很強的穿透力，能夠迅速進入到細胞內部；但在血液系統(tǒng)腫瘤方面研究較少。有研究報道GS能夠激活CaspaSe-3和下調Bcl-2蛋白水平，其誘導細胞凋亡的作用主要是通過線粒體途徑，下調Bcl-2，改變

3、跨膜電位，促進膜通透孔開放，激活Caspase-3而實現(xiàn)的。 小檗胺(Berbamine，BBM)是從我國中草藥小檗科(Berberis)植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，小檗胺及其衍生物均為鈣調素拮抗劑(Calmodulin antagonist)。近來有研究發(fā)現(xiàn)，小檗胺不僅具有逆轉白血病耐藥的作用，而且也有明顯的抗腫瘤作用。BBM對慢性粒細胞白血病急變期K562細胞、Imatini耐藥的K562細胞及原代白血病細胞的生長

4、均具有明顯的抑制作用，并可誘導白血病細胞凋亡，但其作用分子機制仍不十分清楚。有研究報道BBM誘導K562細胞凋亡過程中出現(xiàn)的明顯的Caspase-3表達水平增高。由于這兩種藥物在誘導K562細胞凋亡過程中具有一定的交叉點，所以我們選擇這兩種藥物聯(lián)合使用，探討其誘導細胞凋亡的通路是否有相加性，從而能否進一步增強誘導K562細胞凋亡的作用。 Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的IAPs家族獨特成員，Survivin基因定位于17q25染色體，在正常

5、人的胎盤和胸腺組織中有微弱表達，在其他正常組織中幾乎都檢測不到。Survivin在近乎所有的常見惡性腫瘤組織及白血病中都有過量表達，其高表達常提示患者預后不良。Survivin能夠抑制細胞凋亡、促進細胞增殖，并在細胞的有絲分裂中起重要作用。Survivin可抑制凋亡通路下游的Caspase-3和Caspase-7的酶原轉變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-3和Caspase-7，從而發(fā)揮抗凋亡作用。因此以該基因為靶點，可為基因治療白血病提供很好

6、的途徑。 Caspases(cystein aspartate-specific proteases)是一組具有高度同源性，并且與細胞因子成熟和細胞凋亡有關的蛋白酶，在細胞凋亡信號轉導中具有重要作用。Caspases家族被發(fā)現(xiàn)至今其成員已超過14種，其中Caspase-3在很多正常細胞或者腫瘤細胞中均有表達，是Caspases瀑布式激活反應中重要的效應分子，可激活其他的Caspases，被稱為“放大器”蛋白酶。因此Caspase

7、-3是細胞凋亡過程中的激活的關鍵酶，也是細胞凋亡的主要效應分子，其活性的改變直接影響細胞凋亡產生。在細胞凋亡執(zhí)行過程中，Caspase-3作為凋亡級聯(lián)途徑中的關鍵酶，可全部或者部分識別并水解相應底物蛋白。一旦被凋亡信號途徑激活，Casoase-3能將細胞內相應蛋白質降解，使細胞不可逆的走向死亡。 細胞色素C(cytochrome，Cyt C)是一種水溶性蛋白，位于線粒體內外膜之間，并與內膜松弛相連。Cyt c除參與細胞有氧呼吸活

8、動外，在激活Caspases及誘導細胞凋亡方面具有重要意義。當其從線粒體位移至細胞質中并與凋亡活化因子-1(apoptotic protease-activating factor，Apaf-1．)結合后，再與procaspase-9相互作用，形成凋亡復合體，從而激活Caspase-3，啟動凋亡級聯(lián)反應從而引發(fā)細胞凋亡。本研究中我們選擇Survivin、Cyt c、Caspase-3這三種有緊密聯(lián)系的蛋白作目的本實驗旨在研究GS與BBM

9、聯(lián)合及單獨用藥誘導K562細胞凋亡的分子機制：首先分別檢測不同濃度GS、BBM單獨作用對K562細胞的增殖抑制率，得出二者單獨作用的最佳有效濃度；然后將此二最佳有效濃度聯(lián)合應用，觀察其聯(lián)合應用對細胞的凋亡誘導作用，為臨床聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)；檢測兩種藥物單獨以及聯(lián)合應用誘導細胞凋亡的過程中Survivin、Caspase-3蛋白表達水平的變化以及胞漿中Cyt c蛋白含量的變化來探討其誘導K562細胞凋亡的相關分子機制，并觀察兩者是否有協(xié)

10、同促細胞凋亡效應。 方法 細胞培養(yǎng)，以不同劑量的藥物處理慢性粒細胞白血病急變期K562細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的變化并拍照；用細胞計數(shù)法計數(shù)細胞生長情況并描繪細胞生長曲線；MTr比色法檢測細胞增殖抑制情況并計算增殖抑制率，找出兩種藥物單獨作用的最佳有效濃度；并將此二最佳有效濃度聯(lián)合應用再次檢測細胞增殖抑制情況并計算增殖抑制率；取對數(shù)期生長期細胞，隨機分為四組：對照組(未用藥物處理的K562細胞)、實驗1組(5.0m

11、mol/L，GS處理的K562細胞)、實驗2組(10mg/LBBM處理的K562細胞)、實驗3組(5.0mmol/LGS和10mg/LBBM聯(lián)合處理的K562細胞)；流式細胞術(FCM)檢測細胞早期凋亡率并檢測Caspase-3、Survivin蛋白表達水平的變化；Western blot檢測藥物作用前后線粒體是否有Cyt c蛋白釋放入胞漿的變化。 結果 MTT比色法結果顯示5.0mmil/L GS與10mg/L BBM

12、為抑制細胞增殖的最佳有效濃度，且實驗3組對K562細胞增殖抑制作用明顯增強。細胞凋亡率顯示各實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)，在72h時實驗3組細胞凋亡率明顯增高為 (71.09±1.24)％，聯(lián)合用藥呈現(xiàn)很強的協(xié)同增強效應。實驗3組Caspase-3、Survivin蛋白的陽性表達率在72小時分別為(78.46±0.12)％、(8.24±0.45)％，前者明顯高于對照組(7.56±1.33)％(P<0.01)、而后者則明

13、顯低于對照組(38.24±0.14)％(P<0.05)。Western blot結果顯示72h實驗3組細胞胞漿中Cyt c蛋白含量顯著高于對照組和實驗1、2組(P<0.05)。結論1．GS、BBM單獨及聯(lián)合用藥均可抑制K562細胞的增殖，且聯(lián)合用藥后對K562細胞的增殖抑制作用更為明顯。 2．檢測細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥后K562細胞的早期凋亡率明顯高于對照組及單獨用藥組，說明兩者聯(lián)合使用可以增強誘導K562細胞凋亡的作用，具有

14、協(xié)同效應，且有一定的時間依賴性。 3．實驗過程中伴有胞漿Cyt c蛋白含量升高、Survivin蛋白表達的下調、Caspase-3蛋白表達的上調。 4．二者單獨用藥對K562細胞的凋亡誘導作用主要是通過線粒體-Caspases途徑，并推測聯(lián)合用藥后對細胞的凋亡誘導作用的增強是因為此途徑的相加性。 5．Survivin蛋白的減少可以在一定程度上緩解對Caspase-3的抑制作用，進一步增強誘導K562細胞凋亡作用。