氨基葡萄糖硫酸鹽誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡中Cathepsin D與Bcl-XL作用研究.pdf

1、研究背景：
　　細(xì)胞是機(jī)體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，在機(jī)體代謝過程中相互協(xié)調(diào)，其中細(xì)胞凋亡（apoptosis）對(duì)于調(diào)節(jié)組織發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式，一種基本的生命現(xiàn)象，參與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育及衰老等多種生理過程，同時(shí)也是參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機(jī)制的重要因素。細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子調(diào)控機(jī)制一直是生命科學(xué)研究領(lǐng)域包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)非常重要的基本問題。雖然目前凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途

2、徑已經(jīng)明確，溶酶體是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要結(jié)構(gòu)，且在不同誘導(dǎo)因素引發(fā)凋亡時(shí)，其凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑存在差異，但在多種誘因下溶酶體與線粒體之間凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機(jī)制尚未明確。
　　本實(shí)驗(yàn)是在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，既往我們發(fā)現(xiàn)氨基葡萄糖硫酸鹽（GlucosamineSulfate，GS）可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，并且這種凋亡是通過溶酶體途徑釋放CathepsinD(CatD)介導(dǎo)的，而且與Bcl-XL的下調(diào)相關(guān)結(jié)果
　　1．0.5m

3、mol.L-1、1.0mmol.L-1、5.0mmol.L-1的GS誘導(dǎo)均有細(xì)胞抑制作用，5.0mmol.L-1的GS抑制性最強(qiáng)。HE染色對(duì)照組K562細(xì)胞呈圓形，邊界光滑，胞膜無皺縮，而5.0mmol.L-1GS處理72h后，細(xì)胞皺縮，胞膜不光滑，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象并且細(xì)胞有出芽現(xiàn)象。5.0mmol.L-1GS處理72h后Hoechst33342染色顯示出凋亡細(xì)胞存在。5.0mmol.L-1GS處理72h后DNAladder的電泳圖片上出現(xiàn)

4、180-200bp明顯條帶；在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中對(duì)照的K562細(xì)胞，也有少許凋亡，為腫瘤細(xì)胞的自發(fā)凋亡，而經(jīng)過5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h后的K562細(xì)胞，凋亡明顯增多。與未處理的K562細(xì)胞相比5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h后凋亡率由3.8％變成12.4％,P<0.05，。
　　2．經(jīng)過5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h后的K562細(xì)胞，CatD與Bcl-XL的激光共聚焦信號(hào)明顯增強(qiáng)，CathepsinD蛋白表達(dá)增

5、加，而Bcl-XL蛋白表達(dá)減少。K562細(xì)胞經(jīng)用PepstatinA處理，再用5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h較GS處理組的CatD的表達(dá)減弱，CatD與Bcl-XL的共定位信號(hào)較處理前的信號(hào)明顯增強(qiáng)，CatD蛋白表達(dá)減少，而Bcl-XL蛋白表達(dá)則沒表現(xiàn)出明顯差異。
　　3．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾RNA后免疫熒光雙標(biāo)的激光共聚焦顯示：分別轉(zhuǎn)染CatDsiRNA和Bcl-XLsiRNA組的K562細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染抑制的信號(hào)在共定位的信號(hào)中明

6、顯減弱。5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h分別轉(zhuǎn)染CatDsiRNA和Bcl-XLsiRNA組中，CatD與Bcl-XL的共定位信號(hào)CatD相對(duì)增強(qiáng)。與轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞相比，GS誘導(dǎo)凋亡前后CatD蛋白表達(dá)增加而Bcl-XL蛋白表達(dá)未見明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1．成功構(gòu)建氨基葡萄糖硫酸鹽誘導(dǎo)慢性髓性白血病的凋亡模型。5mmol.L-1的GS誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡作用明顯；
　　2．5mmol.L-1的GS誘導(dǎo)的

7、凋亡細(xì)胞CatD與Bcl-XL的共定位信號(hào)明顯增強(qiáng)。而CatD蛋白表達(dá)增加，Bcl-XL蛋白表達(dá)減少。在PepstatinA抑制CatD后，再用5mmol.L-1的GS誘導(dǎo)與單純的5mmol.L-1的GS誘導(dǎo)的K562細(xì)胞，可以看出在PepstatinA抑制后，CatD與Bcl-XL的共定位信號(hào)中顯現(xiàn)CatD的信號(hào)增強(qiáng)。CatD蛋白表達(dá)減少，而Bcl-XL蛋白表達(dá)則沒表現(xiàn)出明顯差異。
　　3．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾RNACatD與Bcl-