肝再生增強(qiáng)因子對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用研究.pdf

1、全文分為二部分 第一部分 目的：利用已構(gòu)建的大鼠肝再生增強(qiáng)因子(rALR)畢赤酵母(pichiapastoris)重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-rALR，在酵母菌GSll5中誘導(dǎo)表達(dá)rALR，并進(jìn)行純化和體外生物學(xué)活性鑒定，為進(jìn)一步研究rALR的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。 方法：經(jīng)PCR鑒定的重組質(zhì)粒pPIC9K-rALR酶切線性化后轉(zhuǎn)入宿主菌GS115中，在甲醇誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物rALR經(jīng)超濾方法純化后，用15％S

2、DS-PAGE和Westemblot印跡鑒定。運(yùn)用3H-TdR摻入法，觀察rALR在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞株QGY的促增殖作用。 結(jié)果：目的蛋白rALR以外分泌方式在宿主菌GS115中獲得高效表達(dá)，其分子量約為15KD，與預(yù)計(jì)理論值相符合，超濾純化得到的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Westernbolt鑒定為單一條帶；在體外rALR確能刺激QGY增殖，而且這種刺激作用存在著量效關(guān)系。 結(jié)論：rALR在畢赤酵母菌中被高效表達(dá)和成

3、功純化；在體外rALR確能以劑量依賴關(guān)系刺激人肝癌細(xì)胞株QGY增殖。 第二部分 目的：初步探討肝再生增強(qiáng)因子(ALR)在小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞(TEMT)中的作用以及ALR對(duì)TGF-p1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。 方法：以人近端腎小管上皮細(xì)胞株(HK2)為研究對(duì)象，分為以下4組：1.陰性對(duì)照組；2.TGF-pl(10ng/m1)組；3.rALR(10ng/ml,250ng/ml,1u

4、g/ml,20ug/m1)組；4.TGF-pl(10ng/m1)+rALR(10ng/ml,250ng/ml,1ug/ml,2Oug/m1)組。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察HK2細(xì)胞形態(tài)的變化。應(yīng)用間接免疫熒光法檢測(cè)HK2細(xì)胞內(nèi)角蛋白及波形蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：1.TGF-βl誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞從原有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形肌成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；角蛋白的表達(dá)明顯減弱，波形蛋白的的表達(dá)明顯增強(qiáng)。2.單純r(jià)ALR對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、角蛋白