c-fos反義寡核苷酸探針對(duì)大鼠炎性痛和神經(jīng)病理性痛的影響.pdf

1、疼痛（pain）是當(dāng)今困擾人類健康最嚴(yán)重的病癥之一，由于其作用機(jī)理尚不完全清楚，到目前為止，臨床上仍然沒有完善和系統(tǒng)的治療方法減輕患者的痛苦。隨著分子神經(jīng)生物學(xué)的興起，從分子和基因水平探討神經(jīng)活動(dòng)的規(guī)律以期闡明疼痛的分子機(jī)制是目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1]。本實(shí)驗(yàn)以福爾馬林致炎性痛模型和SNL誘導(dǎo)神經(jīng)病理性痛模型為基礎(chǔ)，觀察應(yīng)用c-fosASO對(duì)于大鼠痛行為和脊髓背角內(nèi)神經(jīng)元活化標(biāo)記物c-fos表達(dá)的影響，探討c-fos在病理性疼痛中

2、的作用，為臨床慢性疼痛的治療提供理論依據(jù)。
　　目的：研究c-fos反義寡核苷酸探針（antisense oligodeoxynucleotides,ASO）對(duì)大鼠急性炎性痛和慢性神經(jīng)病理性痛的作用效果及其可能的機(jī)制，為臨床慢性疼痛的治療提供理論依據(jù)。
　　方法：以大鼠足底注射福爾馬林（formalin 5﹪，50μl）致炎性痛模型和腰5脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation,SNL)誘導(dǎo)神經(jīng)病理性痛模型為基

3、礎(chǔ)，分別觀察鞘內(nèi)給予c-fosASO對(duì)兩種模型大鼠的行為學(xué)及腰5脊髓背角Fos陽性神經(jīng)元表達(dá)的影響。選擇健康成年雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為3組，分別是formalin組（n=8）；SNL（n=16）；對(duì)照組（n=6）。鞘內(nèi)置管術(shù)[2]后3d，選擇狀態(tài)良好，無活動(dòng)障礙的動(dòng)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)[3]。
　　1.formalin組：進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的大鼠在注射formalin前4h，分別鞘內(nèi)注射c-fosASO（50μg/10μl，n=4），c-

4、fosSO（50μg/10μl，n=4），NS（10μl，n=2），推進(jìn)速度為0.5μl/s。注射formalin后立即將大鼠放回實(shí)驗(yàn)箱開始檢測(cè)，記錄自formalin注射起1h內(nèi)每5min的自發(fā)縮足反射次數(shù)。
　　2.SNL組：鞘內(nèi)置管成功的大鼠行SNL[4]，大鼠以戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉后行L5脊神經(jīng)緊密結(jié)扎，選擇術(shù)后1d恢復(fù)良好的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠隨機(jī)分為2組：預(yù)處理組（于SNL術(shù)前4h鞘內(nèi)給藥），其又分為3個(gè)小組

5、：鞘內(nèi)注射(1)c-fosASO（50μg/10μl，n=4），(2)c-fosSO（50μg/10μl，n=4），(3)NS（10μl，0.9％，n=2）。每只大鼠在給藥前4h及給藥后4h、1～3d進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。另一組為后處理組（大鼠于SNL術(shù)后3d鞘內(nèi)給藥），同樣分為3個(gè)小組：鞘內(nèi)注射(1)c-fosASO（50μg/10μl，n=4），(2)c-fosSO（50μg/10μl，n=4），(3)NS（10μl，0.9％，n=2）。

6、大鼠于術(shù)后兩周每天進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)[5]。
　　3.行為學(xué)檢測(cè)：用vonFrey纖維絲測(cè)定大鼠的機(jī)械性縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）[6]；用熱輻射法測(cè)定大鼠的熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency,TWL）[7]。
　　4.免疫組化實(shí)驗(yàn)：所有的動(dòng)物在行為學(xué)觀察結(jié)束后即開始免疫組化實(shí)驗(yàn)，觀察SNL大鼠在鞘內(nèi)給藥后脊髓背角Fos蛋白的表達(dá)情況

7、。
　　結(jié)果：
　　行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果：足底皮下注入formalin可誘致持續(xù)、單向性痛行為反應(yīng)（包括縮足反射和抬足/舔足行為），且持續(xù)1～2h以上[7]。鞘內(nèi)預(yù)先給予c-fosASO、SO、NS后，ASO處理使formalin誘導(dǎo)的縮足反射顯著降低（P<0.01），SO處理使縮足反射輕度降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　L5SNL模型能誘導(dǎo)顯著的、長(zhǎng)時(shí)程機(jī)械性痛敏以及熱痛敏[4]。術(shù)前4h鞘內(nèi)預(yù)先給藥，與對(duì)照組

8、比較，ASO處理使SNL1d、2dMWT和TWL有明顯差異（Fig.4A-B,P<0.01）；SNL3dMWT有明顯差異（Fig.4A,P<0.05），TWL無明顯差異（Fig.4B,P>0.05）。術(shù)后3d鞘內(nèi)給藥，SNL2周MWT和TWL無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Fig.4C-D,P>0.05）。
　　免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果：足底皮下注射formalin2h后，在注射側(cè)L4～L5脊髓背角觀察到大量Fos陽性神經(jīng)元（Fig.2A）。陽性神

9、經(jīng)元主要位于背角淺層（Ⅰ、Ⅱ?qū)樱?，在Ⅲ～Ⅴ層也有散在分布。在鞘?nèi)預(yù)先給予c-fosASO、SO、NS后，formalin模型大鼠脊髓背角淺層Fos陽性神經(jīng)元表達(dá)情況數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（Fig.3），c-fosASO組背角淺層Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少（P<0.01）。
　　SNL引起同側(cè)脊髓背角內(nèi)Fos陽性神經(jīng)元顯著增加，對(duì)側(cè)背角內(nèi)Fos陽性神經(jīng)元表達(dá)很少。鞘內(nèi)給藥后，c-fosASO組比較對(duì)照組明顯減少。L5SNL模型在術(shù)前4h鞘內(nèi)預(yù)

10、先給藥，SNL1d、3d觀察到c-fosASO使Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少（P<0.05）；在術(shù)后3d鞘內(nèi)給藥，SNL7d大鼠脊髓背角Fos陽性神經(jīng)元表達(dá)無明顯減少（P>0.05）（Fig.5，F(xiàn)ig.6）。
　　結(jié)論：脊髓背角c-fos的活化對(duì)于炎性痛和神經(jīng)病理性痛的發(fā)展均有顯著意義，而抑制其活化對(duì)慢性疼痛的緩解作用方面，預(yù)防作用比治療作用更為顯著。預(yù)防性給予c-fosASO能夠顯著降低脊神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛敏，而當(dāng)痛敏已