siRNA干擾Bmi-1對膀胱癌5637細(xì)胞增殖抑制作用的研究.pdf

1、目的：Bmi-1作為一種原癌基因，它的高表達(dá)是腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一。因此，利用RNA干擾技術(shù)，通過抑制原癌基因的表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的，是目前正積極探索的一條新的腫瘤治療途徑。本研究通過構(gòu)建反義Bmi-1的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染膀胱癌5637細(xì)胞，使其產(chǎn)生的反義mRNA封閉膀胱癌5637細(xì)胞中Bmi-1的表達(dá)，以觀察其對膀胱癌5637細(xì)胞生長的抑制作用以及對膀胱癌5637細(xì)胞株生物學(xué)性質(zhì)的影響，從而探討反義Bmi-1抑制膀胱

2、癌5637細(xì)胞增殖的作用機(jī)理，為膀胱癌的治療提供新的思路。
　　 方法：1.根據(jù)siRNA的設(shè)計原則、載體的酶切位點(diǎn)、promage公司在線siRNA設(shè)計程序以及GenBank中Bmi-1的編碼序列，合成針對。Bmi-1核心編碼區(qū)的寡聚核苷酸片段，并將靶位點(diǎn)的序列、陰性對照的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列同源的序列，設(shè)計合成相應(yīng)的小發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）。
　

3、　 2.與pGeneClipTM質(zhì)粒退火連接，構(gòu)建針對Bmi-1的siRNA重組質(zhì)粒pshRNA-Bmi-1及陰性對照的重組質(zhì)粒pshRNA-錯配。
　　 3.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中，產(chǎn)生大量克隆。
　　 4.在體外轉(zhuǎn)染中利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒導(dǎo)入膀胱癌5637細(xì)胞中。
　　 5.用MTT法檢測RNA干擾對膀胱癌5637細(xì)胞活力的影響并確定最佳反應(yīng)條件。
　　 6.利用RT-PCR檢測Bmi-1的

4、mRSA轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　 7.倒置顯微鏡下觀察膀胱癌5637細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)電泳確證針對Bmi-1基因的shRNA重組質(zhì)粒pshRNA-Bmi-1及陰性對照的重組質(zhì)粒pshRNA-錯配構(gòu)建成功。
　　 2.轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞成功后生成大量重組質(zhì)?？寺?br>　　 3. siRNA干擾Bmi-1基因?qū)е耣mi-1基因表達(dá)明顯減少、細(xì)胞凋亡并顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長。MTT法可見

5、空轉(zhuǎn)染組及pshRNA-錯配對膀胱癌5637細(xì)胞細(xì)胞無顯著抑制作用（P>0.05），兩組pshRNA-Bmi-1對膀胱癌5637細(xì)胞均有明顯的抑制作用（P<0.05）；確定陽性處理組半數(shù)致死濃度為：1×10-8mmol/L，時間為48小時；兩組陽性處理組間抑制率無明顯差別（P>0.05）；陽性處理組中膀胱癌5637細(xì)胞生長均呈不同程度地減慢，隨著時間的延長，抑制率增加，隨著濃度的增加，抑制率也得到增加，表現(xiàn)為細(xì)胞生長受到siRNA濃度及

6、時間的雙重影響；
　　 4. RT-PCR后通過圖處理軟件分析條帶的灰度值，可見正常對照組、空白對照組與兩組陽性處理組（加入siRNA1組及加入siRNA2組）之間的灰度值比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而正常對照組、空白對照組、陰性處理組（加入siRNA1-錯配1）、陰性處理組（加入siRNA2-錯配2）幾組灰度值未見明顯改變（P>0.05）；
　　 5.倒置顯微鏡下可見正常對照組、空白對照組、陰性對照組膀胱癌