基于TEM-8新型顆粒性疫苗的構(gòu)建、鑒定及其抗腫瘤免疫的研究.pdf

1、背景和目的:
　　 實(shí)體瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成,因此,抗腫瘤血管生成也成為抗腫瘤治療的一種有效手段。目前,針對(duì)于VEGF為靶點(diǎn)的被動(dòng)免疫抗血管生成的藥物在臨床上取得了一定進(jìn)展后,隨之而來的抗腫瘤血管生成治療也在不斷的深入,以激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)為主的主動(dòng)免疫治療策略在惡性腫瘤的綜合治療中發(fā)揮了重要作用。與其它傳統(tǒng)的治療方法相比較,主動(dòng)免疫治療能誘導(dǎo)自身的腫瘤特異性

2、免疫應(yīng)答,不但可以識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞,而且還可以誘發(fā)免疫記憶,阻止腫瘤的復(fù)發(fā)。同時(shí)能夠減少持續(xù)給藥給患者帶來的麻煩和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所以,抗腫瘤血管生成疫苗的運(yùn)用前景非常具有吸引力。到目前為止,抗腫瘤血管生成的分子疫苗治療中,靶抗原主要是VEGFR-2,VEGF,FGFR,MMP-2分子等,但是這些分子不僅在腫瘤細(xì)胞組織中表達(dá)豐富,而且在一些正常組織內(nèi)表達(dá)量也較高,所以針對(duì)類似靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的分子疫苗對(duì)自身有一定的潛在危害性。
　　

3、2000年Croix發(fā)現(xiàn)了9條在結(jié)腸癌血管內(nèi)皮中特異性高表達(dá)的基因,分別命名為腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物1～9(tumor endothelial markers,TEMs)。經(jīng)原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在成年小鼠體內(nèi),TEM-8的mRNA在正常組織中不表達(dá)或者微量表達(dá),而在其腫瘤內(nèi)皮中的表達(dá)卻非常豐富。在人體內(nèi),TEM-8mRNA和TEM-8蛋白幾乎在所有的結(jié)腸癌、食管癌、膀胱癌、肺癌病例中高表達(dá),而在同一病例的癌旁組織和正常組織中卻不表達(dá),在黃體及傷口

4、愈合過程中的新血管中也沒有檢測(cè)出TEM-8蛋白分子。這些研究結(jié)果提示TEM-8是目前最理想的免疫治療候選靶點(diǎn)之一。在后來的分子疫苗研究中證實(shí)TEM-8所構(gòu)成的單獨(dú)的分子疫苗免疫原性較低,而與其他抗原結(jié)合以后可以有效的激發(fā)免疫反應(yīng),后來的學(xué)者在臨床上引入DC疫苗后可以有效的提高TEM-8的免疫原性,抗瘤效果明顯,但是存在轉(zhuǎn)運(yùn)效率不高,操作不方便,費(fèi)用高等特點(diǎn)。
　　 陽離子肽類DNA轉(zhuǎn)運(yùn)載體(cationic peptides D

5、NA delivery systems)是進(jìn)展較快的領(lǐng)域之一。該類DNA轉(zhuǎn)運(yùn)載體為一些富含正電荷氨基酸的多肽,如多聚賴氨酸(ploylysine,[K]n),它們可通過電性中和作用與富含負(fù)電荷(磷酸根基團(tuán))的質(zhì)粒DNA發(fā)生聚合、壓縮,從而將直徑約數(shù)百納米、松散的質(zhì)粒DNA聚縮成為幾十納米的致密顆粒,使之易于被真核細(xì)胞攝入從而達(dá)到基因轉(zhuǎn)染的目的。構(gòu)建“肽-DNA復(fù)合疫苗”,這種疫苗可以打破自身耐受,操作方便,是比較理想的選擇之一。

6、　　 本課題的目的就在于評(píng)估基于TEM-8的分子疫苗經(jīng)過陽離子穿膜肽改造后的抗腫瘤免疫治療的有效性和毒副作用,從而評(píng)價(jià)是否有必要對(duì)TEM-8進(jìn)行更多的免疫治療方面的研究。
　　 方法:
　　 1.我們首先構(gòu)建陽離子融合肽[K]16-tat49-57,融合肽經(jīng)反相高壓液相色譜鑒定其純度,用質(zhì)譜鑒定其分子量,在特定NaCI濃度下,將其與富含負(fù)電荷的pTEM-8真核表達(dá)質(zhì)粒結(jié)合構(gòu)建成新型顆粒性疫苗,用透射電鏡掃描顯示其顆粒大

7、小,用westernblot檢測(cè)TEM-8蛋白的表達(dá);
　　 2.構(gòu)建CT-26結(jié)腸癌模型,我們以基于TEM-8的新型顆粒性疫苗免疫Balb/c小鼠,研究疫苗的抗瘤能力。免疫小鼠每周一次,連續(xù)三次。觀察小鼠的生存時(shí)間和腫瘤體積變化情況,用免疫組化觀察腫瘤組織血管生長情況,并計(jì)算腫瘤微血管密度;
　　 3.確認(rèn)了疫苗的抗腫瘤作用之后,我們進(jìn)一步研究了疫苗的抗腫瘤機(jī)理和毒副作用;
　　 結(jié)果:
　　 1.對(duì)合

8、成的多肽進(jìn)行高效液相色譜鑒定其純度達(dá)到了96.57％用質(zhì)譜分析其分子量為3390.44 Da,并成功構(gòu)建了顆粒性疫苗,透射電鏡及軟件分析,其顆粒大小均勻,直徑小于25nm,符合疫苗要求,并對(duì)其轉(zhuǎn)染和免疫印跡檢測(cè)分子量為63KD符合預(yù)期結(jié)果;
　　 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,基于TEM-8的顆粒性疫苗免疫組的腫瘤體積與對(duì)照組有明顯差異(p＜0.05),荷瘤小鼠生存期延長。腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞采用抗CD31單克隆抗體作免疫組織化學(xué)染色,結(jié)

9、果顯示TEM-8疫苗免疫組微血管密度(MVD)較對(duì)照組明顯降低;
　　 3.在激發(fā)CTL的51Cr釋放實(shí)驗(yàn)證明,經(jīng)過疫苗免疫的小鼠能夠激發(fā)CTL免疫反應(yīng),ELISPOT檢測(cè)顯示在體內(nèi)疫苗能有效激發(fā)抗原特異性CTL效應(yīng),分別利用抗CD4+或者抗CD8+單抗作保護(hù)性免疫試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗CD8+時(shí),小鼠不能獲得疫苗免疫后的保護(hù)性效果;而在抗CD4+時(shí),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腫瘤體積仍然有顯著性差異(p＜0.05),提示CD8+T細(xì)胞在抗腫