基因重組生長激素對心肌缺血-再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：心肌保護(hù)是心臟外科至關(guān)重要而又長研不衰的課題。以高鉀為主要成份的各種心肌保護(hù)液的臨床應(yīng)用明顯改善了體外循環(huán)手術(shù)中心肌保護(hù)效果和心臟手術(shù)成功率，但心肌缺血—再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion iniury MIRI)仍未得到根本解決。冠狀動脈溶栓術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)、冠狀動脈旁路移植術(shù)的廣泛開展，也使得心肌缺血—再灌注損傷越來越受到廣大基礎(chǔ)和臨床工作者的重視，成為一個(gè)亟需

2、解決的重要問題。缺血預(yù)適應(yīng)是機(jī)體產(chǎn)生對心肌缺血—再灌注損傷的一種內(nèi)源性保護(hù)作用，盡管動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明其確切的心肌保護(hù)效果，但由于倫理觀念的影響在臨床上很難實(shí)施。心肌缺血—再灌注損傷的發(fā)生與很多因素有關(guān)，其中最主要的就是：(1)氧自由基(OFR)的作用：(2)鈣的作用：主要是鈣超載；(3)內(nèi)皮細(xì)胞的激活導(dǎo)致內(nèi)皮介質(zhì)釋放失衡，細(xì)胞表面特性改變，產(chǎn)生血管收縮、白細(xì)胞粘附等效應(yīng)。同時(shí)促使大量中性粒細(xì)胞(PMNs)和血小板在血管內(nèi)皮表面粘附和

3、聚集，導(dǎo)致微血栓形成和毛細(xì)血管堵塞，產(chǎn)生“無復(fù)流”現(xiàn)象；(4)炎癥反應(yīng)的作用：心肌缺血一再灌注時(shí)成熟心肌細(xì)胞合成、分泌腫瘤壞死因子(TNFα)，干擾鈣的調(diào)控影響心肌興奮—收縮耦聯(lián)，進(jìn)而影響心臟收縮和舒張功能，同時(shí)還干擾心肌細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)其他心肌抑制物質(zhì)如IL—1、IL-2的生成。(5)中性粒細(xì)胞通過與其他細(xì)胞的相互作用介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞損傷：同時(shí)產(chǎn)生氧自由基和蛋白酶損傷心肌。除此之外，心肌細(xì)胞凋亡與心肌缺血一再灌注損傷有著非常密切的

4、關(guān)系，而且已引起廣大基礎(chǔ)和臨床工作者的關(guān)注，成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，但是心肌缺血一再灌注如何誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡在心肌缺血一再灌注后的不同時(shí)點(diǎn)有什么樣的變化規(guī)律，國內(nèi)還未見類似報(bào)道。生長激素(GH)是垂體前葉分泌的一種含有191個(gè)氨基酸的多肽，與心血管系統(tǒng)有著非常密切的關(guān)系。人工合成基因重組生長激素對體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的抗凋亡作用和缺血性壞死心肌的保護(hù)作用已有有報(bào)道，但是對在體心肌缺血一再灌注損傷的保護(hù)作用以及模擬體外循環(huán)預(yù)

5、充液中加入rGH是否能夠減少心臟手術(shù)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，通過什么機(jī)制來減少心肌細(xì)胞凋亡仍是需要解決的問題。在考慮到這些問題的基礎(chǔ)上，我們設(shè)計(jì)了這一課題以尋求一種抑制心肌細(xì)胞凋亡的藥物進(jìn)而減輕心臟外科手術(shù)中的心肌缺血一再灌注損傷。 目的：運(yùn)用wistar大鼠制作心肌缺血一再灌注模型，探討心肌缺血一再灌注后不同時(shí)段心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及相關(guān)基因的變化規(guī)律，并研究基因重組生長激素(recombinant human growth horm

6、one rGH)對心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因Bcl-2、BAX mRNA表達(dá)的影響，為臨床缺血性心臟病及心臟外科手術(shù)中心肌缺血一再灌注損傷的防治提供新的思路和方法。 方法： wistar大鼠78只，體重250g±20g，通過阻斷左冠狀動脈的前降支建立心肌缺血模型，達(dá)到預(yù)定的缺血時(shí)間后，使血管再通，建立心肌的缺血一再灌注模型。采用透射電鏡、原位末端探針標(biāo)記、RT-PCR技術(shù)、圖像分析和統(tǒng)計(jì)處理對缺血一再灌注損傷區(qū)心肌細(xì)胞的損傷

7、情況及相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行研究。 1．動物分組： (1)心肌缺血一再灌注組(IR組) 術(shù)前7天皮下注射生理鹽水lml，每天1次。手術(shù)中以5-0 prolene線在左心耳與肺動脈圓錐之間下方左冠狀動脈前降支起始段下2mm處阻斷45min后再灌注。分別于缺血一再灌注后2h、4h、24h、48h 4個(gè)時(shí)點(diǎn)采取血樣及心肌標(biāo)本。 (2)心肌缺血一再灌注+基因重組生長激素基礎(chǔ)治療組Ⅰ(IR+GH Ⅰ組)術(shù)前7天

8、每只皮下注射基因重組生長激素注射液0.75IU/Kg。缺血一再灌注模型的建立，樣本檢測時(shí)機(jī)、手段、方法均與第一組相同。 (3)心肌缺血一再灌注+基因重組生長激素沖擊治療組Ⅱ(IR+GH Ⅱ組) 缺血前半分鐘經(jīng)靜脈注射基因重組生長激素注射液ⅡU/Kg。缺血一再灌注模型的建立，樣本檢測時(shí)機(jī)、手段、方法均與第一組相同。 (4)假手術(shù)對照組(C組) 開胸后對于左冠狀動脈前降支只穿線不結(jié)扎。 2．檢測方法與指標(biāo)：(1)取左

9、心室前壁心肌梗死與非梗死區(qū)心肌組織作透射電鏡檢查以觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，(2)以TUNEL法進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測，(3)運(yùn)用RT-PCR法測定心肌組織Bc1-2 mRNA和BAX mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1．心肌超微結(jié)構(gòu)變化結(jié)果顯示對照組肌節(jié)清晰，細(xì)胞無水腫，肌漿網(wǎng)無擴(kuò)張，線粒體無腫脹，內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整，電子密度中等：心肌缺血一再灌注組(IR組)線粒體呈不同程度的腫脹，結(jié)構(gòu)破壞，嵴排列紊亂甚至斷裂，部分線粒體空泡化，

10、外膜完整性消失，基質(zhì)密度下降，核質(zhì)邊聚，糖原顆粒分布稀少，心肌毛細(xì)血管內(nèi)皮破壞，管腔出現(xiàn)細(xì)胞碎片；在再灌注后的同一時(shí)點(diǎn)，術(shù)前給予生長激素組(IR+GH I組)則線粒體結(jié)構(gòu)破壞程度減輕，空泡化和核質(zhì)邊聚不明顯，糖原顆粒較多，而術(shù)中給予生長激素組(IR+GHⅡ組)線粒體結(jié)構(gòu)破壞的程度和心肌纖維斷裂的情況與IR組相比無明顯差別。 2．心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)TUNEL 法進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)對照組細(xì)胞核為藍(lán)色，未見

11、棕黃色的凋亡細(xì)胞： (2)IR 組心肌缺血45min后再灌注2小時(shí)開始出現(xiàn)的心肌細(xì)胞凋亡，凋亡指數(shù)為(14.36±0.912)％，4小時(shí)增加到(17.06±1.678)％，24小時(shí)達(dá)高峰，為(20.25±1.112)％，再灌注后48小時(shí)凋亡指數(shù)下降到(16.19±1.029)％； (3)IR+GH Ⅰ組再灌注后2h、4h、24h、48h的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(13.45±0.940)％，(14.76±2.111)％，(

12、17.82±1.216)％和(14.71±0.992)％； (4)IR+GH Ⅱ組再灌注后2h、4h、24h、48h的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(14.19±0.843)％，(16.13±1.227)％，(19.88±0.995)％和(15.86±1.246)％： (5)IR組內(nèi)4個(gè)時(shí)點(diǎn)之間采用方差分析發(fā)現(xiàn)除再灌注后4h和48h之間無差別外，其余各組相比P值均<0.01； IR組與IR+GHI組的4個(gè)時(shí)點(diǎn)分別進(jìn)行比較(t檢

13、驗(yàn))發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)具有明顯差異，計(jì)算P值分別<0.05，0.05，0.01，0.01； (6)IR+GH Ⅱ組與IR組的4個(gè)時(shí)點(diǎn)分別進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)無差別，計(jì)算P值皆大于0.05； 1．心肌Bcl-2 mRNA和BAX mRNA的表達(dá)運(yùn)用RT-PCR技術(shù)測定心肌缺血一再灌注后不同時(shí)點(diǎn)Bcl-2 mRNA和BAX mRNA的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)： (1)對照組Bcl-2 mRNA的表達(dá)為0.17

14、6±0.033，BAX mRNA的表達(dá)為0.103±0.036，BAX/bcl．2比值為O.585±0.0344； (2)IR組心肌缺血45min后再灌注2小時(shí)Bcl－2 mRNA的表達(dá)下降為0.134±0.023，4小時(shí)為0.101±0.020，24小時(shí)達(dá)最低值0.068±0.01l，48小時(shí)回升到0.116±0.047：再灌注后2小時(shí)BAXmRNA上升為0.142±0.047，4小時(shí)達(dá)0.17±0.032，24小時(shí)為0.21

15、6±0.03l，48小時(shí)繼續(xù)上升到0.2664±0.033；BAX/Bcl－2比值分別為0.902±0.217，1.687±0.164，3.231±0.290，2.520±0.714。 (3)IR+GHI組再灌注后2h、4h、24h、48h Bcl-2 mRNA的表達(dá)分別為0-172±0.028，0.15±0.039，0.105±0.017和O.167±0.029；BAX mRNA的表達(dá)分別為0.093±0.021，0.129±

16、0.029，0.169±0.017和0.215±0.033；BAX/Bcl-2比值分別為0.521±0.066，0.772±0.045，1.616±0.118，1.289±0.075。 (4)IR+GHⅡ組再灌注后2h、4h、24h、48h Bcl-2mRNA的表達(dá)分別為0.130±0.029，0.091±0.027，0.059±0.022和0.101±0.037；BAX mRNA的表達(dá)分別為0.153±0.036，0.179±

17、0.021，0.242±0.061和0.296±0.025；BAX/Bcl－2比值分別為1.109±0.106，1.807±0.325，3.959±0.756，3.236±1.104。 (5)IR組內(nèi)4個(gè)時(shí)點(diǎn)之間采用方差分析，P<0.0l：IR+GH I組與IR組的4個(gè)時(shí)點(diǎn)分別進(jìn)行比較(t檢驗(yàn))發(fā)現(xiàn)，Bcl－2 mRNA的表達(dá)情況有明顯差異，計(jì)算P值分別<0.05，0.05，0.01，0.05：BAX mRNA的表達(dá)情況也有明顯

18、差異，計(jì)算P值分別<0.05，0.05，0.0l，0.05；各時(shí)點(diǎn)BAX/Bcl-2比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P值皆<0.0l。 ． (6)IR+GHⅡ組與IR組的4個(gè)時(shí)點(diǎn)分別進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 mRNA的表達(dá)情況和BAX mRNA的表達(dá)情況均無差別，計(jì)算P值皆大于0.05。 結(jié)論： 1．心肌缺血45分鐘再灌注后2小時(shí)開始出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡，24小時(shí)達(dá)高峰，再灌注后48小時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)減少。 2．術(shù)前7

19、天皮下注射基因重組生長激素能減少缺血一再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡，線粒體結(jié)構(gòu)破壞較輕；而術(shù)前30秒給予基因重組生長激素?zé)o此作用，說明GH發(fā)揮其抗凋亡作用需要一定的時(shí)間。 3．心肌缺血一再灌注后Bcl-2 mRNA表達(dá)減少，24小時(shí)達(dá)最低值，48小時(shí)后回升，與心肌細(xì)胞凋亡的變化趨勢呈負(fù)相關(guān)：BAX mRNA表達(dá)從再灌注后2小時(shí)到48小時(shí)一直處于上升趨勢，與心肌細(xì)胞凋亡的變化趨勢不一致：但BAX/Bcl-2比值的變化趨勢與心肌細(xì)胞凋亡