脂肪肝體內(nèi)外模型的建立及藥物篩選.pdf

1、目的：脂肪肝是代謝綜合癥的表現(xiàn)，早期表現(xiàn)為單純性脂肪變性，其后可能還會發(fā)生脂肪性肝炎，肝纖維化，肝硬化。它的高發(fā)病率越來越受到重視。積極研究開發(fā)治療脂肪肝的高效、價廉、方便、安全的藥物意義重大。本課題探討建立脂肪肝體外模型和動物模型，觀察姜黃素衍生物JZ2、SFR1和四氫姜黃素對體內(nèi)外脂肪肝模型的保護作用。
　　 方法：(1)采用油酸作用于肝癌細胞HepG2和人正常肝細胞株L02的方法在體外建立脂肪肝細胞模型，并應用MTT法篩選

2、姜黃素衍生物JZ2、SFR1及四氫姜黃素作用于肝細胞的非細胞毒濃濃度，以油紅0染色，觀察不同給藥組非細胞毒濃度對細胞內(nèi)脂滴形成情況，并檢測細胞上清液的ALT、AST及γ-GT。從而觀察藥物在體外抗脂肪肝的作用效果。(2)通過給予高脂飼料、腹腔注射四環(huán)素的復合方式建立小鼠脂肪肝的模型，同時給予不同劑量的姜黃素衍生物JZ2、SFR1和四氫姜黃素固體分散劑，于實驗第36天，取血及肝組織，計算肝指數(shù)、檢測血脂及肝功：血清TG、CHO、LDL-C

3、、HDL-C、ALT、AST，肝臟內(nèi)脂質(zhì)：肝勻漿TG、CHO；采用肝臟冰凍切片及油紅0染色、病理切片等手段觀察肝臟的病理變化。從而觀察藥物在小鼠體內(nèi)抗脂肪肝的療效。
　　 結(jié)果：⑴通過MTT法篩選出姜黃素衍生物JZ2、SFR1的非細胞作用濃度為100ug/ml、200 ug/m1、300 ug/ml、400 ug/ml，四氫姜黃素的非細胞作用濃度為10 ug/ml、20 ug/ml、30 ug/ml；⑵油紅0染色后，在光鏡下觀察

4、發(fā)現(xiàn)80 ug/ml油酸刺激HepG2細胞24小時后，模型組細胞內(nèi)有大量的紅色脂滴積聚，48小時后紅色脂滴開始減少；60 ug/ml油酸刺激L02細胞24小時后，模型組細胞內(nèi)有大量的紅色脂滴積聚，72小時后細胞紅色脂滴開始減少。間隔24小時兩次給藥，藥物作用于HepG2細胞48、72小時均未見脂滴減少;藥物作用于L02細胞48小時未見脂滴減少；藥物作用于L02細胞72小時隨著作用濃度的增加細胞內(nèi)的脂滴逐漸減少。⑶用ImagePro Pl

5、us6.0圖像分析軟件分析藥物對油酸刺激48h后L02細胞的油紅0染色圖片，各給藥組與模型組比較，脂滴顯著減少(P＜0.05)。其中四氫姜黃素30ug/ml，JZ2300ug/ml，SFR1400ug/ml差異有極顯著性區(qū)別(P＜0.01)。⑷檢測細胞上清液中ALT、AST、γ-GT，表明四氫姜黃素對肝功能影響較小，JZ2、SFR1對肝功能均有一定影響。⑸通過給予高脂飼料、腹腔注射150mg/kg四環(huán)素的復合方式成功建立了小鼠脂肪肝的模

6、型，與正常組相比，模型組小鼠的肝指數(shù)、血清TG、CHO、LDL-C、ALT、AST以及肝勻漿TG、CHO均顯著升高(P＜0.05)。肝臟冰凍切片油紅0染色、肝臟病理切片及HE染色也證實其發(fā)生了脂肪肝病變；⑹與模型組相比，四氫姜黃素固體分散劑對CHO、LDL-C、HDL-C有降低趨勢，但在低劑量組作用更顯著，部分數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學意義，對TG作用不明顯。在肝指數(shù)、肝內(nèi)脂質(zhì)特別是TG、肝功ALT、AST方面都有下降作用，且有明顯的劑量依賴關(guān)系。2

7、00mg/kg組、300mg/kg組對肝指數(shù)、肝內(nèi)脂質(zhì)(TG)、肝功ALT的改善具有統(tǒng)計學意義。冰凍切片油紅0染色及病理切片也證明四氫姜黃素對小鼠脂肪肝的保護作用。⑺與模型組比較，姜黃素衍生物JZ2在高、低劑量組對血脂TG、CHO、LDL-C有不同程度的降低，部分數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學意義， TG、HDL-C在低劑量組作用更好。SFR1高低劑量對血脂CHO、LDL-C不同程度的降低，部分數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學意義，但對TG影響不理想。兩藥對小鼠的肝指數(shù)、肝

8、臟內(nèi)脂質(zhì)無明顯作用。冰凍切片油紅0染色及病理切片與模型組比較沒有明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論：(1)建立了較穩(wěn)定的脂肪肝體外篩藥模型：油酸刺激L02細胞48小時，在油酸刺激前24小時藥物給藥一次，24小時后與油酸一起再給藥一次，可以篩選出藥物的體外抗脂肪肝作用。(2)建立了小鼠脂肪肝模型：高脂飼料、腹腔注射150mg/kg四環(huán)素。(3)姜黃素衍生物JZ2、SFR1與四氫姜黃素均具有一定干預脂肪肝體外模型的作用，有效減少細胞內(nèi)脂滴的形成