高氧致CLD早產(chǎn)鼠p16基因啟動子甲基化及其對肺纖維化作用的研究.pdf

1、早產(chǎn)兒慢性肺疾病(CLD)是早產(chǎn)兒長時間吸入高濃度氧、機械通氣治療或感染后的最常見并發(fā)癥。盡管其發(fā)生機制尚不清楚，但早期的肺泡上皮損傷及晚期不可逆的肺間質(zhì)纖維化的病理結局已被公認。近年來，隨著極低出生體重兒的存活率明顯提高，CLD的發(fā)生率也在逐年增加，現(xiàn)已成為威脅早產(chǎn)兒健康和生命的首要疾病。雖然CLD的病因復雜，但長時間吸入高濃度氧氣目前被學者們認為是早產(chǎn)兒CLD發(fā)生的最主要原因及最危險因素。因此，探索高氧致早產(chǎn)兒CLD肺纖維化的發(fā)生機

2、制是國內(nèi)外研究的焦點問題。
　　 早產(chǎn)兒CLD的主要病理變化是肺成纖維細胞增生、細胞外基質(zhì)的沉積及肺組織的纖維化。目前有關其發(fā)病機理的研究多集中在如下幾個方面：(1)因早產(chǎn)兒肺組織的抗氧化能力尚不成熟(如超氧化物岐化酶等缺乏)，當長時間吸入高濃度氧后，大量的氧自由基生成，導致氧化應激性肺損傷。(2)細胞因子作用的結果。越來越多的證據(jù)表明，CLD的發(fā)生與多種細胞因子的協(xié)調(diào)作用密切相關。其中涉及促炎和促纖維化的細胞因子包括：IL-1

3、、IL-6、IL-8、TNF-α等，這些物質(zhì)引起炎癥反應過程，募集并刺激炎癥細胞。另外，IL4、IL-10、TGF-β1、VEGF等細胞因子發(fā)揮抗炎、促纖維化及調(diào)節(jié)新生血管形成的作用。(3)細胞外基質(zhì)(ECM)動態(tài)平衡的破壞也參與了CLD的發(fā)生?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一個蛋白水解酶家族，主要作用降解細胞外基質(zhì)，在肺發(fā)育過程中起重要作用。膠原酶MMP-1和MMP-8降解Ⅰ型膠原(細胞外基質(zhì)的主要結構蛋白)，明膠酶MMP-2、MMP-

4、9降解Ⅳ型膠原(肺基底膜的主要成分)。金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)調(diào)節(jié)了MMPs的活性。若上述MMPs表達水平減少或TIMPs表達增加都可使ECM沉積而發(fā)生纖維化。
　　 p16基因又稱多腫瘤抑制基因，最早是作為一重要的抑癌基因被發(fā)現(xiàn)的，直接作用于細胞周期，抑制細胞的增殖，目前被認為是重要的細胞周期調(diào)控因子。近年來已經(jīng)成為生命科學領域的熱點研究。在腫瘤的研究中已發(fā)現(xiàn)，p16基因啟動子區(qū)域的甲基化異常對其基因表達有明顯的抑制

5、作用，可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達，從而引起相應表達基因的沉默。大量的研究資料結果表明，因p16基因的啟動子甲基化而引發(fā)的p16失活與多種惡性腫瘤、腸上皮化生、銀屑病、燒傷后瘢痕的形成及衰老的發(fā)生等等密切相關。那么在早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生中，因肺間質(zhì)成纖維細胞異常增殖而導致的肺纖維化是否與上述疾病有類似的基因調(diào)控過程，尚有待于研究和闡明。
　　 故本研究將在我們以往研究的基礎上，以高氧誘導的早產(chǎn)鼠CLD模型和分離培養(yǎng)的肺間質(zhì)的成纖維細

6、胞為研究對象，從組織學、細胞和分子的水平，研究p16基因在CLD肺纖維化中作用機制，從新的角度探索早產(chǎn)兒肺纖維化的發(fā)生機制，從而為重新設計CLD的有效防治途徑尋找新的突破口。
　　 實驗材料及方法：
　　 一、動物模型制備
　　 本實驗在中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院實驗動物中心完成。實驗組將剖宮取出的早產(chǎn)Wistar大鼠(連同母鼠)生后立即置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，維持FiO2為0.90(用測氧儀監(jiān)測)，CO2濃度＜0.

7、5％(用鈉石灰吸收CO2)，溫度25℃～27℃，濕度50％～70％，每24 h定時開箱30 min，添加水、飼料及更換墊料，并與對照組交換母鼠以避免其因氧中毒致喂養(yǎng)能力下降。對照組FiO2為0.21，具體方法及實驗控制因素同實驗組。
　　 二、標本采集和處理
　　 每組分別于實驗后3，7，14和21d隨機選取10只Wistar早產(chǎn)鼠麻醉(5％水合氯醛0.6ml/100mg)后處死，將左肺組織置于4％多聚甲醛中固定，石蠟包

8、埋，常規(guī)制備5μm組織切片。右肺組織置于無Rnase的Eppendorf管中，-80℃凍存，用于其他指標檢測。
　　 三、肺成纖維細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 分別于實驗后3，7，14和21d隨機選取Wistar早產(chǎn)鼠6只，經(jīng)5％水合氯醛(0.6ml/100mg)腹腔麻醉后處死，無菌條件下迅速取肺，采用胰酶消化、離心、反復貼壁法，分離純化早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞，并進行原代培養(yǎng)，經(jīng)波形蛋白免疫細胞化學染色方法鑒定，按1∶2或3

9、接種傳代，取第三代肺成纖維細胞用于實驗。
　　 四、實驗方法和觀察指標
　　 (一)肺形態(tài)學觀察：切片進行常規(guī)HE染色，光鏡下動態(tài)觀察肺組織的病理改變及進行肺組織纖維化程度的判定。
　　 (二)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺組織Ⅰ型膠原的含量。
　　 (三)免疫組化法及Western-blot技術觀察和檢測肺組織p16蛋白的表達狀態(tài)及水平。
　　 (四)MSP和半巢式PCR檢測肺組織p16

10、基因啟動子的甲基化狀態(tài)。
　　 (五)半巢式PCR檢測肺成纖維細胞的p16基因啟動子的甲基化狀態(tài)。
　　 (六)RT-PCR技術檢測肺組織和肺成纖維細胞p16 mRNA表達水平。
　　 (七)免疫組化法觀察肺成纖維細胞p16、PCNA的蛋白表達。
　　 (八)MTT法觀察肺成纖維細胞生長活力。
　　 五、統(tǒng)計學分析
　　 應用SPSSll.5統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料采用x2檢驗，計量資料采用

11、t檢驗，相關性分析采用Spearman,采用Logistic回歸法求OR值(比值比)，分析關聯(lián)度。顯著性檢驗水平為0.05。
　　 結論；
　　 1、暴露高氧中早產(chǎn)鼠，其肺組織的p16 mRNA及蛋白的表達水平降低，其低水平的表達狀態(tài)與高氧致CLD肺纖維化的發(fā)生密切相關。
　　 2、高氧可導致早產(chǎn)鼠的肺組織p16基因啟動子的甲基化異常，且其甲基化的發(fā)生率隨高氧暴露時間的延長而逐漸增加。
　　 3、高氧誘導