應(yīng)用Rh陰性孕婦外周血游離胎兒DNA進行RhD血型的產(chǎn)前基因診斷.pdf

1、利用Rh陰性孕婦血漿中提取的游離胎兒DNA，來尋求一種胎兒RhD血型產(chǎn)前基因診斷的可行性方法，并以此作為診斷和預(yù)防新生兒溶血病的一種手段推廣于臨床應(yīng)用，本文將從以下兩個方面進行探討。 一、應(yīng)用PCR-SSP技術(shù)進行胎兒RhD血型的基因診斷已有的研究資料顯示Rh血型基因(RH)位于人類染色體1p34.3～36.1區(qū)域，主要由緊密連鎖的RHD和RHCE基因串聯(lián)排列組成。RHD基因編碼RhD多肽，RHCE基因編碼RhC/c和RhE/e

2、多肽。臨床上通過檢測紅細(xì)胞膜表面有無D抗原將Rh血型分為Rh陽性和Rh陰性兩種。Rh血型血清學(xué)檢測主要是D、C、E、c和e等5種抗原，其中D抗原具有很強的免疫原性，它是Rh陰性孕婦與胎兒血型不合引起新生兒溶血病(HDN)發(fā)生的最主要抗原之一。經(jīng)研究表明不同種族Rh陰性個體因遺傳背景不同RHD基因結(jié)構(gòu)存在很大差異，高加索人中Rh陰性個體絕大部分是RHD基因完全缺失；中國人約有38％Rh陰性個體存在不同程度攜帶RHD等位基因；非洲黑人有80

3、％Rh陰性個體普遍攜帶RHD等位基因，其中66％為RHD假基因(RHDψ)。 目前，我國產(chǎn)前診斷胎兒RhD血型是依靠從絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞或羊水中獲得胎兒DNA，然后對胎兒組織DNA進行RHD基因的擴增，該方法為侵入性取材，有引起胎兒流產(chǎn)以及加重胎兒病情的危險。另一方面，借用國外基因定型的方法僅擴增外顯子10，該方法不適合用于中國人的檢測，易造成假陽性。近年來，通過RHD等位基因的深入研究以及孕婦血漿中游離胎兒DNA的發(fā)現(xiàn)，為非侵入

4、性產(chǎn)前診斷胎兒RhD血型提供了新思路。 國外關(guān)于利用RhD陰性孕婦血漿游離DNA進行胎兒RhD血型產(chǎn)前診斷的研究已獲得成功，并在臨床上開始逐步推廣和運用。在我國，因D變異體的多樣性和復(fù)雜性，與國外相比D變異體的基因結(jié)構(gòu)和頻率存在很大差異，國外有關(guān)RhD血型的基因分型方法并不適合中國人。在亞洲，約30％的RhD陰性個體為Del表型，該表型的等位基因有10多種，在我國僅發(fā)現(xiàn)一種等位基因RHDl227A，并成為我國Del表型基因診斷的

5、特征性遺傳標(biāo)志物。本實驗借鑒國外的一些基因定型方法，再結(jié)合我國Rh血型D抗原變異體最新研究成果來設(shè)計相應(yīng)的特異性引物，采用PCR-SSP技術(shù)成功地預(yù)測出胎兒RhD血型，探索出了一條適合于中國人RhD血型產(chǎn)前基因診斷的方法，該方法可用于新生兒溶血病的診斷和預(yù)防以及臨床推廣運用。實驗方法l、篩選孕周為11～40周，B超確定為單胎的孕婦。 2、用常規(guī)血清學(xué)方法篩選出RhD陰性孕婦。 3、采用德國Qiagen公司DNA提取試劑盒

6、提取孕婦血漿中游離DNA。 4、建立PCR-SSP檢測方法用于RhD血型的基因定型。 5、利用胎-母共有的β-globin(GLO)基因檢測總DNA。 6、利用男性胎兒所特有的SRY基因確定孕婦血漿中游離胎兒DNA。 7、根據(jù)RHD和RHCE外顯子、內(nèi)含子之間的差異設(shè)計一套特異性引物進行擴增。 8、結(jié)合我國Del表型等位基因結(jié)構(gòu)特點設(shè)計一套引物對基因定型RhD陽性者進一步進行Del血型篩選。

7、 9、篩選的Rh陰性孕婦產(chǎn)后新生兒性別觀察并收集臍血進行Rh血型血清學(xué)鑒定。 10、利用新生兒臍血進行吸收-放散試驗檢測Del表型。 結(jié)果： 1、血清學(xué)方法篩選出RhD陰性孕婦58例。 2、通過GLO和SRY基因擴增同時出現(xiàn)陽性結(jié)果32例。 3、擴增內(nèi)含子4、外顯子5、7、10基因結(jié)果全部陽性24例。 4、擴增內(nèi)含子4、外顯子5、7、10結(jié)果全部陰性6例。 5、1例只擴增出外顯子

8、7、10。 6、1例僅擴增出外顯子10。 7、24例擴增結(jié)果全部陽性的樣本進一步擴增RHD1227A等位基因出現(xiàn)陽性結(jié)果2例。 8、基因定型結(jié)果與胎兒臍血血清學(xué)表型結(jié)果相一致28例，其符合程度達到87.5％(28/32)。 9、通過檢測RHD1227A等位基因鑒定了RhD放散型2例，最終準(zhǔn)確率93.75％(30/32)。 結(jié)論： 利用PCR-SSP技術(shù)，結(jié)合中國人RhD血型D抗原變異體基因

9、結(jié)構(gòu)特點設(shè)計的一套特異性引物，應(yīng)用于Rh陰性孕婦血漿中游離胎兒DNA擴增進行非創(chuàng)性診斷胎兒RhD血型是一種簡便、快速、準(zhǔn)確度高且無損傷性的產(chǎn)前基因診斷的可行性方法，可用于新生兒溶血病的預(yù)防和診斷，值得臨床推廣應(yīng)用。 二、應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)進行胎兒RhD血型的基因診斷在前期工作中，我們運用了PCR-SSP方法僅對男性胎兒進行了RhD血型的預(yù)測，沒有對女性胎兒進行檢測。為了獲得完整的研究資料，同時也為了排除方法上的一些技術(shù)因素所

10、造成的干擾，更是為了提高檢測方法的靈敏度和特異性，我們采用了實時定量PCR技術(shù)再次成功地預(yù)測出胎兒RhD血型，并建立了一套完整地胎兒RhD血型產(chǎn)前基因診斷的可行性方法。 實驗方法： 1、尋找孕周為11～40周，經(jīng)B超確定為單胎的孕婦。 2、用常規(guī)血清學(xué)方法篩選出RhD陰性孕婦。 3、采用德國Qiagen公司DNA提取試劑盒提取孕婦血漿中游離DNA。 4、采用北京PEL-FREEZ公司DNA提取試劑

11、盒提取孕婦白細(xì)胞層DNA。 5、利用胎-母共有的β-globin(GLO)基因檢測總DNA的存在。 6、利用男性胎兒所特有的SRY基因確定孕婦血漿中胎兒游離DNA的存在。 7、SRY基因擴增結(jié)果為陰性的，進一步對孕婦白細(xì)胞層DNA及其游離DNA分別進行STR多態(tài)性重復(fù)序列的擴增，通過對比尋找胎兒游離DNA中可能存在的父源性基因片斷。 8、根據(jù)RED和RHCE外顯子、內(nèi)含子之間的差異設(shè)計一套特異性引物。

12、 9、利用標(biāo)準(zhǔn)品建立特異性基因拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。 10、采用實時定量PCR技術(shù)進行檢測。 11、結(jié)合我國Del表型基因結(jié)構(gòu)特點設(shè)計一套引物對基因定型RhD陽性者進一步篩選。 12、篩選出的Rh陰性孕婦產(chǎn)后新生兒性別觀察并收集臍血進行Rh血型血清學(xué)鑒定。 13、純化RHD1227A等位基因擴增陽性產(chǎn)物，進一步進行直接測序。 結(jié)果：1、血清學(xué)方法篩選出RhD陰性孕婦78例。 2、通過GLO

13、和SRY基因擴增陽性結(jié)果41例，證實了胎兒DNA的存在。 3、 37例SRY基因擴增結(jié)果陰性樣品DNA進行STR多態(tài)性分析全部獲得父源性基因片段，證實了從血漿中提取胎兒DNA獲得成功。 4、內(nèi)含子4、外顯子5、7、10基因擴增結(jié)果全部陽性65例。 5、內(nèi)含子4、外顯子5、7、10基因擴增結(jié)果全部陰性10例。 6、1例只有外顯子7、10擴增出陽性結(jié)果。 7、2例僅有外顯子10擴增出陽性結(jié)果。

14、 8、65例擴增結(jié)果全部陽性的樣品DNA進一步擴增RHD1227A等位基因出現(xiàn)陽性結(jié)果5例。 9、基因定型結(jié)果與血清學(xué)表型結(jié)果相符70例，總符合率為90％(70/78)。 10、5例出現(xiàn)RHD1227A等位基因陽性產(chǎn)物直接測序顯示在外顯子9和內(nèi)含子9之間1227位置存在G>A堿基突變。 11、通過檢測RHD1227A等位基因鑒定了RhD放散型5例，最終準(zhǔn)確率95％(74/78)。 結(jié)論： 運用實時